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尽管心血管疾病的防治在近年来有了很大发展,但仍是发病率和致死率最高的疾病,造成沉重的经济和社会负担。心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)是多种心血管系统疾病终末期的共同病理表现,有效地抑制或逆转心肌纤维化是防止心力衰竭、心律失常及心源性猝死等严重不良事件的重要策略。其形成机制复杂,目前并未完全阐明。因此亟待从全新角度探索心肌纤维化潜在致病机制,寻找新的防治靶标,从而有效降低心血管事件的发生。本室前期研究发现,在大鼠孕期给予炎症刺激剂脂多糖(lipopolysaccharides,LPS),可导致子代大鼠6周龄时血压明显升高,随着血压的升高,仔鼠16周龄出现心室重构,32周龄时心室重构加剧并伴有心肌舒张功能障碍。鉴于血压升高可导致心室后负荷持续加重,我们推测孕期炎症刺激可能诱导子代大鼠心肌纤维化。缝隙连接(gap junction,GJ)是细胞间直接进行物质交换的膜通道,参与心脏功能的调节,缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)是心肌组织主要的缝隙连接蛋白。本研究在孕期炎症刺激子代大鼠模型的基础上,探讨心脏缝隙连接异常、Cx43表达改变与孕期炎症刺激致子代心肌纤维化发生的关系,结合心肌成纤维细胞原代培养给予刺激剂/阻断剂,初步揭示心脏自噬、DNA甲基化修饰在孕期炎症刺激诱导子代大鼠心肌Cx43异常表达以及心肌纤维化中的作用。本研究从全新角度揭示了心肌纤维化的发病机制,为其它成年慢性疾病的研究提供有益的借鉴。方法1.动物模型的建立将孕鼠随机分成两组,对照组(control,Con)及脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激组(LPS),Con组在孕第8~14天每天腹腔注射无菌生理盐水0.5 ml;LPS组分别在孕第8、10、12天腹腔注射LPS 0.79 mg/kg,孕第9、11、13及14天分别注射无菌生理盐水0.5 ml。各组子代大鼠在4周龄时断乳,雌雄分笼并予以正常饮食。2.子代大鼠相关指标检测各组大鼠从分笼之日起,每周测量其体重和身长,并且每隔一天测其进食量;Masson染色观察8、16周龄子代大鼠的左心室组织;免疫荧光法检测8、16周龄子代大鼠左心室α-SMA和Cx43的表达;透射电镜观察子代8、16周龄时左心室超微结构;实时荧光定量聚合酶链式反应(real time Polymerase chain reaction,RT-PCR)法和蛋白免疫印迹法(western blotting,WB)分别检测8及16周龄子代大鼠心室Cx43、LC3、DNMT1、DNMT 3A、DNMT 3B的m RNA和蛋白表达;心肌成纤维细胞原代培养,LPS(10μg/ml)、血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)(20μM)、甘珀酸(carbenoxolone,CBX)(400μM)、LPS(10μg/ml)+Ang II(20μM)、LPS(10μg/ml)+CBX(400μM)、Ang II(20μM)+CBX(400μM)作用于2~4代原代心肌成纤维细胞24h,通过显微镜观察细胞形态,运用RT-PCR和WB分别检测细胞中Cx43、LC3、DNMT 1、DNMT 3A、DNMT3B的m RNA和蛋白的表达。结果1.与Con组相比,LPS组子代大鼠从4周龄至8周龄进食量(P<0.001)、体重(P<0.01)、Lee’s指数(P<0.05)均明显增加;4至6周龄,体长显著增长(P<0.05)。2.光镜观察Masson染色发现,8周龄LPS组子代大鼠左室心肌纤维增粗且排列紊乱,间质和血管周围大量胶原沉积,胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)显著升高(P<0.01),16周龄时心肌纤维组织损伤加重、胶原沉积更趋明显。3.左心室组织α-SMA免疫荧光染色显示,8、16周龄孕期LPS刺激子代大鼠心室α-SMA荧光的强度均比Con组增强;8、16周龄孕期LPS刺激子代大鼠心室Cx43荧光的强度均比Con组减弱。4.透射电镜观察发现,8周龄LPS组子代大鼠细胞结构破坏,缝隙连接数量减少,细胞的间隙增大,细胞内自噬小体的数量增加;16周龄细胞损伤加重,缝隙连接数量减少,自噬小体的数量增加。5.8周龄LPS组子代大鼠心室肌组织中Cx43(P<0.05)、LC3(P<0.001)和DNMT1(P<0.05)的m RNA表达均明显低于Con组;16周龄LPS组子代大鼠心室肌组织中Cx43(P<0.01)和DNMT 1(P<0.05)的m RNA表达明显高于Con组,LC3的m RNA表达比Con组明显减少(P<0.01)。8周龄和16周龄子代大鼠两组间DNMT 3A和DNMT 3B的m RNA表达没有明显的统计学差异。6.与Con组比较,8周龄孕期LPS刺激子代大鼠心室肌组织中Cx43(P<0.05)、LC3 II/I(P<0.05)和DNMT 1(P<0.01)的蛋白表达明显减少;16周龄孕期LPS刺激子代大鼠心室肌组织中Cx43的蛋白表达下降(P<0.05),LC3 II/I和DNMT 1的蛋白明显增加(P<0.05)。8周龄和16周龄子代大鼠的DNMT 3A和DNMT 3B的蛋白表达在各组间均没有统计学差异。7.LPS、Ang II、CBX、LPS+Ang II、LPS+CBX、Ang II+CBX分别作用于原代培养的心肌成纤维细胞,显微镜下观察,成纤维细胞出现分化,呈片状延伸的细胞突起增多;LPS组、Ang II组、LPS+Ang II组的细胞间隙相对紧密,CBX组、LPS+CBX组、Ang II+CBX组的细胞间隙变宽。8.LPS、Ang II、CBX、LPS+Ang II、LPS+CBX、Ang II+CBX分别作用于原代培养的心肌成纤维细胞,Cx43 m RNA的表达在LPS组(P<0.001)、Ang II组(P<0.01)、CBX组(P<0.01)均明显低于Con组;与LPS组相比,LPS+CBX组Cx43 m RNA表达显著降低(P<0.05);Ang II+CBX组中的Cx43m RNA表达低于Ang II组(P<0.05);Cx43 m RNA的表达在LPS组与LPS+Ang II组、Ang II组与LPS+Ang II组、CBX组与LPS+CBX组和Ang II+CBX组之间Cx43 m RNA表达均没有明显的统计学差异。LPS组(P<0.01)、Ang II组(P<0.05)、CBX组(P<0.01)LC3 m RNA表达比Con组明显降低;LPS+CBX组的LC3 m RNA表达低于LPS组(P<0.05);Ang II+CBX组较Ang II组中的LC3 m RNA表达明显降低(P<0.01);与CBX组相比,LPS+CBX组LC3 m RNA表达降低(P<0.05);LPS组与LPS+Ang II组、Ang II组与LPS+Ang II组以及CBX组与Ang II+CBX组之间的LC3 m RNA表达均没有明显的统计学差异。与Con组相比,LPS组(P<0.01)和Ang II组(P<0.05)DNMT 1 m RNA表达明显升高,CBX组DNMT 1 m RNA表达降低(P<0.05);与Con组相比,CBX组m RNA表达降低(P<0.05);LPS+CBX组的DNMT 1 m RNA表达明显低于LPS组(P<0.01);Ang II+CBX组相较Ang II组的DNMT 1 m RNA表达降低(P<0.05);LPS组与LPS+Ang II组、Ang II组与LPS+Ang II组、CBX组与LPS+CBX组以及Ang II+CBX组之间DNMT 1 m RNA表达都没有明显的统计学差异。CBX组DNMT 3A m RNA表达比Con组表达明显降低(P<0.01);LPS+CBX组的DNMT 3A m RNA表达较LPS组明显降低(P<0.01);Ang II+CBX组相较Ang II组的DNMT 3A m RNA表达明显降低(P<0.01);Con组与LPS组和Ang II组、LPS组与LPS+Ang II组、Ang II组与LPS+Ang II组以及CBX组与LPS+CBX组和Ang II+CBX组之间DNMT 3A m RNA表达均没有明显的统计学差异。Ang II组(P<0.05)和CBX组(P<0.001)DNMT 3B m RNA表达比Con组降低;LPS+CBX组的DNMT 3B m RNA表达比LPS组明显降低(P<0.001);与Ang II组相比,LPS+Ang II组的DNMT 3B m RNA表达明显升高(P<0.05);Con组与LPS组、LPS组与LPS+Ang II组、Ang II组与Ang II+CBX组以及CBX组与LPS+CBX组和Ang II+CBX组之间DNMT 3B m RNA表达均无统计学差异。9.LPS、Ang II、CBX、LPS+Ang II、LPS+CBX、Ang II+CBX分别作用于原代培养的心肌成纤维细胞,与Con组相比,LPS组(P<0.01)、Ang II组(P<0.05)和CBX组(P<0.01)Cx43蛋白表达明显降低;Ang II+CBX组的Cx43蛋白表达较Ang II组减少(P<0.05);LPS组与LPS+Ang II组和LPS+CBX组、Ang II组与LPS+Ang II组、CBX组与LPS+CBX组和Ang II+CBX组之间Cx43蛋白表达均没有统计学差异。LPS组(P<0.05)、Ang II组(P<0.05)和CBX组(P<0.01)LC3 II/I较Con组明显减少;LPS组比LPS+CBX组的LC3II/I升高(P<0.05);LPS组与LPS+Ang II组、Ang II组与LPS+Ang II组和Ang II+CBX组、CBX组与LPS+CBX组和Ang II+CBX组之间LC3II/I均无统计学差异。LPS组和Ang II组中DNMT 1蛋白表达较Con组升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+CBX组的DNMT 1蛋白表达降低(P<0.05);Ang II+CBX组比Ang II组的DNMT 1蛋白表达明显降低(P<0.01);Con组与CBX组、LPS组与LPS+Ang II组、Ang II组与LPS+Ang II组、CBX组与LPS+CBX组和Ang II+CBX组之间DNMT 1蛋白表达均不存在统计学差异。CBX组DNMT 3A蛋白表达比Con组降低(P<0.05);Ang II+CBX组的DNMT 3A蛋白表达比Ang II组降低(P<0.05);而Con组与LPS组和Ang II组、LPS组与LPS+Ang II组和LPS+CBX组、Ang II组与LPS+Ang II组、CBX组与LPS+CBX组和Ang II+CBX组之间DNMT 3A蛋白表达都不存在统计学差异。DNMT 3B蛋白在CBX组较Con组明显降低(P<0.01);与Ang II组相比,Ang II+CBX组的DNMT 3B蛋白表达减少(P<0.05);LPS+CBX组比CBX组的DNMT 3B蛋白表达升高(P<0.05);而Con组与LPS组和Ang II组、LPS组与LPS+Ang II组和LPS+CBX组、Ang II组与LPS+Ang II组、CBX组与Ang II+CBX组之间DNMT 3B蛋白表达均没有统计学差异。结论1.孕期炎症刺激导致子代大鼠发生心肌纤维化。2.心肌组织中缝隙连接的改变以及Cx43异常表达与子代心肌纤维化的发生、发展密切相关,自噬可能介导了Cx43蛋白表达下调。3.孕期炎症刺激导致子代DNA甲基化修饰可能通过直接和/或调控自噬的间接途径参与心肌纤维化的发生、发展。