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目的： 帕金森病(Parkinsons disease，PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病。研究发现在PD病人黑质(substantia nigra，SN)中有铁代谢的改变，由于过量的铁可催化产生具有高度细胞毒性的羟自由基(hydroxyl free radical，OH·)，促进氧化应激反应，从而导致细胞死亡，使其在PD中的作用不容忽视。课题组以往的研究表明，黄芩苷(Baicalin，BI)对鱼藤酮PD大鼠SN纹状体多巴胺(dopamine，DA)能神经具有保护作用，且能够阻止SN损伤后铁在其的积聚，并能降低鱼藤酮致PD大鼠的SN内二价金属离子转运体1(divalent metal transporter1，DMT1)的表达，同时升高膜铁转运蛋白1(ferroportin1，FP1)的表达。本课题研究铁转运蛋白表达、细胞内铁含量、神经细胞损伤三者之间的关系，探讨神经胶质细胞铁积聚的发生过程及发生机制;认识黄芩苷与铁螯合对神经胶质细胞铁转运及转铁蛋白DMT1和FP1表达的影响，认识黄芩苷对神经细胞的保护作用及主要作用机理，从细胞水平为黄芩苷治疗PD提供实验依据。 方法： 实验方法分为四部分，(1)紫外分光光度法检测黄芩苷与柠檬酸铁铵(Ammonium ferric citrate，FAC)的螯合情况;(2)C6细胞贴壁生长后分为4个组:正常对照组、FAC模型组、黄芩苷组(FAC+BI)、注射用甲磺酸去铁胺（Defetoxamine, DFO）组(FAC+DFO)，采取100μg/mL FAC孵育C6细胞48h后，BI+FAC组和DFO+FAC组加等量的100μg/mL黄芩苷或100μg/mL去铁胺溶液，正常对照组和FAC模型组加等量的无血清DMEM(Dulbeccos modificationof Eagles medium Dulbecco)培养液再共同孵育3h，噻唑蓝(3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-diphenytetrazoliumromide，MTT)法检测细胞存活率;细胞免疫组织化学方法观察细胞转铁蛋白DMT1和FP1的表达情况;流式细胞术检测细胞内活化的Caspase-3含量;电感耦合等离子发射光谱法(Inductively coupled plasma atomic emission spectrometry，ICP-AES)检测细胞内铁含量;紫外分光光度法测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)含量，细胞内OH·和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量;(3)C6细胞贴壁生长后分为4个组:正常对照组、FAC模型组、DMT1封闭组、DMT1+FP1封闭组，采取100μg/mL FAC孵育C6细胞48h后，各组均加等量的无血清DMEM培养液再共同孵育3h，ICP-AES检测细胞内铁含量;(4)C6细胞贴壁生长后分为4个组:采取10μg/mL FAC、50μg/mL FAC、100μg/mL FAC及400μg/mL FAC分别孵育C6细胞48h后，各组均加等量的无血清DMEM培养液再共同孵育3h，MTT法检测细胞存活率;细胞免疫组织化学方法观察细胞转铁蛋白DMT1和FP1的表达情况。 结果： 1.黄芩苷与铁在细胞培养体系中发生螯合反应 在细胞培养体系中，黄芩苷与铁发生反应，其螯合物的特征吸收峰440nm处吸光度值明显升高，螯合反应的最佳反应比为1∶1，最大反应时间为3h。 2.黄芩苷与铁螯合对铁负载的C6细胞的保护作用 100μg/mL FAC负载C6细胞48h后，细胞存活率在60％左右，与正常对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，此一结果与细胞培养液中LDH含量、细胞内MDA和OH·含量及细胞内活化的Caspase-3含量均明显高于正常对照组(P＜0.01)同步，同时还可见细胞内铁含量较正常对照组显著增加(P＜0.01)。BI或DFO进行治疗给药3h后，其细胞存活率均较FAC模型组明显升高(P＜0.01)，与此同时，细胞培养液中LDH含量、细胞内MDA和OH·含量及细胞内活化的Caspase-3含量均明显低于FAC模型组(P＜0.01)，且两组间比较也存在显著性差异(P＜0.01)。同时我们还观察到FAC+BI组和FAC+DFO组细胞内铁含量也均较FAC模型组明显减少(P＜0.01)。 3.黄芩苷与铁螯合对铁转运及转铁蛋白DMT1和FP1表达的影响 封闭DMT1组及同时封闭DMT1和FP1组后，细胞内铁含量均较FAC模型组显著降低(P＜0.01)，但仍明显高于正常对照组，且封闭DMT1+FP1组细胞内铁含量较只封闭DMT1组高(P＜0.01)。 100μg/mL FAC负载C6细胞48h后，细胞内DMT1表达较正常对照组显著增加(P＜0.01)的同时，FP1的表达显著降低(P＜0.01)。BI或DFO进行治疗给药3h后，细胞内DMT1表达均较FAC模型组减少(P＜0.01)，而FP1表达升高(P＜0.01)，同时我们发现FAC+BI和FAC+DFO两组细胞内铁含量并无明显差异，但两组细胞内转铁蛋白DMT1和FP1的表达却均存在明显差异(P＜0.01)。 不同浓度FAC(10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、400μg/mL)负载C6细胞48h后，发现C6细胞DMT1的表达随铁负载浓度升高而增加，且与铁浓度在0～400μg/mL内呈正相关，相关系数r=0.9821，而FP1的表达则随铁负载浓度升高而降低，与铁在此浓度范围呈负相关，相关系数r=0.9480，且两种蛋白之间的表达也呈现出负相关，相关系数r=0.9807。此一结果与细胞存活率降低同步。同时我们还发现，不同浓度FAC负载C6细胞后，各组间细胞存活率、转铁蛋白DMT1和FP1的表达大多存在显著性差异(P＜0.01)，仅50μg/mL FAC的FP1表达与100μg/mL FAC组比较存在差异(P＜0.05)。 结论： 1.黄芩苷在细胞培养体系中能与铁发生螯合反应，最大反应比例为1∶1，最佳反应时间为3h。 2.铁负载可使C6细胞内铁含量增加，同时细胞氧应激水平增高，出现损伤。黄芩苷与铁螯合后可降低铁负载的神经胶质细胞内铁含量及氧应激水平，对神经胶质细胞有保护作用。 3.细胞内外铁离子浓度能调节转铁蛋白DMT1、FP1的表达，黄芩苷、去铁胺均能通过与铁螯合，降低游离铁浓度，进而影响两种转铁蛋白的表达，从而产生细胞保护作用。推测此一作用是黄芩苷保护神经细胞的初始作用和主要的作用机制之一。 4.黄芩苷对C6细胞的神经保护作用要优于去铁胺，但两者与铁螯合的能力并无明显差异。推测黄芩苷还有其它的我们尚未认识的保护机制有待进一步的研究，如对线粒体功能的影响以改善能量代谢，降低神经炎性反应或促进损伤修复等等。