肌酸酶是一种医疗应用酶，可用于临床肾功能检测，但由于产量不足和生产成本较高等问题，目前其产量无法满足市场需求，利用传统工业生产菌株进行高效异源表达可以解决这一问题。枯草芽孢杆菌具有良好的蛋白分泌能力，是生产多种工业酶制剂的安全菌株。然而，异源蛋白不能通过枯草芽孢杆菌经典蛋白途径实现高效表达分泌，这限制了枯草芽孢杆菌作为异源蛋白高效表达分泌宿主的工业应用。因此，本研究在枯草芽孢杆菌表达系统基础之上，从转录、翻译和转运等水平上进行综合优化，构建了一株不依赖于经典分泌途径的肌酸酶高产菌株1A751-GC。
　　为有效提高肌酸酶在枯草芽孢杆菌中的表达水平，本研究对肌酸酶基因进行密码子优化，同时对组成型和诱导型两种不同类型的启动子进行评价，成功利用麦芽糖诱导型启动子Pglv实现了肌酸酶的高效表达。然而在上述表达系统中，肌酸酶在无信号肽的情况下即可分泌，基于此，本研究对肌酸酶在枯草芽孢杆菌内的分泌机制进行深入探究。
　　首先，通过对Sec和Tat经典分泌途径以及Holin孔蛋白中关键蛋白元件进行敲除或过表达分析，结果表明肌酸酶的分泌并不依赖以上分泌途径，排除其作为主要蛋白通道分泌肌酸酶的可能。其次使用荧光染料Calcein-AM/PI对表达菌株进行荧光染色分析，发现表达菌株1A751-GC的细胞膜存在不同程度破损。最后，扫描电镜和透射电镜的分析结果也证实表达菌株细胞表面存在泄漏位点，说明肌酸酶在枯草芽孢杆菌中主要是通过细胞泄漏实现分泌。最终通过高密度发酵结合培养基优化，在5L发酵罐上进一步提高了肌酸酶的胞外总酶活，达到141.9U/mL。
　　本研究通过启动子优化，实现肌酸酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达，获得一株高效胞外生产肌酸酶的菌株1A751-GC；同时系统地研究了肌酸酶在枯草芽孢杆菌中不依赖信号肽的分泌机制。本研究结果对提高肌酸酶在微生物细胞中的高效生产具有一定的意义，同时也对不依赖信号肽的异源蛋白的分泌表达具有一定的帮助和指导作用。