近年来,恶性肿瘤的发病率和死亡率日益增长,成为威胁人类健康的重要原因之一。以自由基为基础的肿瘤治疗已广泛应用于临床,自由基主要包括过氧化物、超氧化物、羟基自由基和单线态氧等,可对脂质、蛋白质和DNA造成损伤,引起氧化应激,具有强细胞毒性,进而诱导细胞凋亡。常用的自由基治疗有放射治疗(RT)和光动力治疗(PDT)等。其中光动力治疗(PDT)因其治疗的非侵入性、高选择性、低毒副作用等特点被临床广泛用于多种肿瘤的治疗。然而肿瘤乏氧环境极大降低了 PDT氧依赖的自由基生成,并且肿瘤细胞高抗氧化的内环境如过表达的谷胱甘肽(GSH),也进一步削弱了自由基治疗的效率。然而对于PDT而言,目前大部分光敏剂光毒性大,激光穿透能力差等均限制了其临床应用。因此构建一个不依赖氧气同时可打破肿瘤细胞还原屏障的治疗体系是目前肿瘤高效自由基治疗的需求。基于上述分析,本课题构建了一种兼具乏氧环境高效产生及下调胞内还原微环境的时空可控的自由基治疗体系,该体系主要具备以下特点:(1)利用不依赖氧气的烷基自由基的高效产生治疗肿瘤,2,2’-氮杂双(2-咪唑啉)二盐酸盐(2,2’-azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochloride,AIPH)在热刺激下可迅速分解,产生与氧无关的烷基自由基,具有高的抗肿瘤活性,在肿瘤的乏氧微环境中实现高效治疗;(2)构建兼具光热转换特性及吸附胞内GSH的“纳米活性载体”,在打破肿瘤还原微环境的同时,高时空分辨特异开启烷基自由基产生。中空介孔硫化铜纳米粒(CuS)具有超强的近红外吸收、高的光热转换效率、高的组织渗透能力,可高效装载AIPH,同时降低胞内GSH水平,打破肿瘤还原屏障,在近红外光照射下不仅可作为光热治疗剂,还可激活AIPH产生烷基自由基,实现高时空分辨控制自由基生成;(3)CuS在近红外光照射条件下,可以释放少量的Cu2+离子,发生类芬顿反应产生羟基自由基,增强自由基治疗效果;(4)载药体系表面包覆白蛋白(BSA),减少AIPH的提前泄露,降低毒副作用,改善生物相容性。总之,该自由基治疗体系具有光热激活产生烷基自由基同时打破肿瘤还原屏障的能力,最终实现乏氧肿瘤的高效自由基级联式治疗。具体研究内容如下:1、CuS/AIPH@BSA的制备及表征首先采用模板法制备CuS纳米粒,通过透射电镜(TEM)、X射线衍射(XRD)等手段证明成功制备介孔CuS,其粒径约为100 nm。其次通过物理搅拌将AIPH成功装载到纳米粒内部,其包封率为21.53±1.71%。最后用白蛋白(BSA)对CuS/AIPH表面进行封孔,得到CuS/AIPH@BSA自由基发生器,通过透射电镜、紫外可见光谱等证实了 CuS/AIPH@BSA的成功制备,并且具有良好的分散性,纳米粒度分析仪测得最终粒径为117.4±0.16 nm,电位为-23.2±1.5 mV。此外,对CuS/AIPH@BSA的性质进行考察,首先通过分析红外热成像仪记录的温度,证明了 CuS具有浓度、激光照射时间和功率依赖性。通过电子自旋共振实验以及ABTS+·显色反应,证明了光热可激活烷基自由基的产生。最后,GSH含量测定结果也显示,GSH含量随CuS浓度的增加而降低。2、CuS/AIPH@BSA体外抗肿瘤活性的研究以小鼠乳腺癌细胞(4T1)为模型细胞,对CuS/AIPH@BSA的体外抗肿瘤活性进行评价。在细胞摄取实验中,采用流式细胞仪和激光共聚焦考察4T1细胞对罗丹明B负载的CuS@BSA纳米粒的摄取行为,结果表明与游离组相比,CuS@BSA纳米粒可有效促进AIPH摄取,且摄取效率具有时间依赖性。通过细胞内烷基自由基检测结果表明,CuS/AIPH@BSA自由基发生器在常氧和乏氧状态下均可产生大量烷基自由基。同时胞内GSH含量测定结果显示,激光照射下CuS/AIPH@BSA降低胞内GSH水平至27%左右。由细胞毒性实验结果可知,CuS/AIPH@BSA组细胞存活率在85%以上,而CuS/AIPH@BSA+NIR组,常氧和乏氧细胞存活率均在15%以下,证明制备的载体系统具有较低毒性,AIPH和CuS具有协同抗肿瘤作用,CuS/AIPH@BSA能有效抑制4T1细胞的生长和增殖。由细胞凋亡实验结果可知,CuS/AIPH@BSA+NIR组可有效诱导乏氧细胞的凋亡,凋亡率高达88%,实现肿瘤高效自由基治疗。Western blot实验结果显示,不论常氧还是乏氧条件,CuS/AIPH@BSA+NIR处理组细胞内γ-H2AX表达明显增多,且细胞核内DNA拖尾现象明显,说明该自由基发生器具有很强的核内DNA损伤能力。3、CuS/AIPH@BSA体内抗肿瘤活性的研究以4T1细胞荷瘤小鼠为动物模型,通过观察给药系统在小鼠体内的分布情况、各给药组小鼠的相对肿瘤体积变化、体重的变化、组织切片的H&E染色和TUNEL凋亡染色评价给药系统的体内动力学分布和药效学特性。体内分布结果显示IR783负载的CuS@BSA纳米粒可以有效的聚集在肿瘤部位,且在6h时肿瘤部位的荧光强度达到最大,为确定何时给与激光照射提供依据。经过治疗14天后的小鼠相对肿瘤体积结果可知,与其他组相比,CuS/AIPH@BSA+NIR组的相对肿瘤体积有明显减小的趋势,治疗后相对肿瘤体积变为1.5倍,肿瘤抑制率达67%;肿瘤组织自由基免疫荧光染色结果显示,与其他组相比,CuS/AIPH@BSA+NIR组小鼠肿瘤部位的自由基明显增多,是PBS组的3.32倍;H&E病理切片结果显示,在治疗前后,各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要器官没有明显的病理变化,表明所制备的自由基发生器在体内具有良好的生物相容性。而对肿瘤组织进行病理性分析表明,CuS/AIPH@BSA+NIR治疗的小鼠肿瘤切片出现了显著的细胞数量减少,细胞核皱缩等现象;TUNEL凋亡染色结果显示,CuS/AIPH@BSA+NIR治疗的小鼠肿瘤组织凋亡程度最高。本课题构建了一种兼具乏氧环境高效产生及下调胞内还原微环境的时空可控的自由基治疗体系,该体系具有光热转换特性,高效递送AIPH,同时降低GSH水平,打破胞内还原屏障,高时空分辨控制自由基生成,可实现乏氧肿瘤的高效自由基级联式治疗,体内和体外治疗结果表明该自由基发生器对乏氧肿瘤细胞的凋亡有强诱导作用,有效地抑制了肿瘤生长,在克服乏氧肿瘤环境的高效肿瘤治疗中具有广阔的应用前景,为自由基治疗提供了一种新思路。