黄瓜是重要蔬菜作物之一,分枝是决定黄瓜株型和产量的一个关键因素。黄瓜分枝数是由遗传因素控制的复杂性状,同时受到激素及栽培环境的影响。目前关于黄瓜分枝发育调控机制研究进展缓慢,主要集中在形态观察、QTL定位分析、同源克隆等遗传分析和基因定位上,已克隆的黄瓜分枝调控关键基因非常少,对决定黄瓜分枝数量的生物学基础和遗传调控网络还尚不清楚。因此,鉴定控制黄瓜分枝数量关键基因,解析其作用机制,对黄瓜株型改良和新品种培育具有重要的理论价值和生产实践意义。课题组前期通过正向遗传定位到一个控制黄瓜器官大小和分枝数量的关键基因CsLL（KX450264）,并进一步通过分子标记辅助育种构建了华北型黄瓜9930遗传背景下的ll基因近等基因系材料HAUC106。在此基础上,我们通过遗传转化进一步验证了CsLL基因调控分枝数量的生物学功能,并通过酵母杂交等方法解析了它的遗传调控网络,这些结果对我们进一步解析黄瓜CsLL基因的分子机理打下了坚实的基础。具体结果如下:1.通过对田间定植30 d的黄瓜ll突变体H19、华北型黄瓜9930和HAUC106材料的分枝数量进行表型调查,结果表明9930平均每株有3个分枝,而ll突变体H19及HAUC106材料平均每株分别有12个分枝和9个分枝,表明CsLL基因参与调控黄瓜的腋芽分化。2.为了验证CsLL基因在黄瓜中的生物学功能,我们构建了CsLL基因的过表达载体CsLL-p FGC5941-Flag,通过农杆菌介导转化黄瓜HAUC106材料进行功能互补验证。通过外植体抗性筛选及PCR与试纸鉴定等方法,最终获得6株阳性植株。与对照相比,CsLL过表达植株表现出分枝数量明显减少,几乎没有分枝的产生,qRT-PCR结果显示转基因植株中CsLL基因的表达量显著升高,证明CsLL过表达抑制了侧枝的分化,表明它是一个控制黄瓜分枝的负向调控因子。此外,还观察到阳性植株叶片面积增大且皱缩,叶边缘锯齿加剧。3.运用CRISPR/Cas9技术,使用基因敲除靶点设计在线网站对CsLL基因的CDS区内进行靶位点设计,连接p YLCRISPR/Cas9载体,成功构建CsLL基因的四靶位点基因编辑载体,进行黄瓜遗传转化实验,获得两株Bar抗性的阳性组培苗,然而经DNA测序显示未发生编辑效应,该体系的建立为我们进一步敲除验证CsLL基因的功能打下了技术基础。4.为了分析黄瓜CsLL基因的表达模式,对9930、HAUC106材料的腋芽和开花0 d的子房进行原位杂交实验,结果显示CsLL基因在HAUC106材料中的表达信号强于9930材料,同时切片分析显示HAUC106中的腋芽分化程度高于9930。亚细胞定位预测显示CsLL基因定位在细胞核中,我们构建了35S:CsLL-GFP载体瞬时转化烟草也显示定位在细胞核中。5.前期的转录组分析发现有多个TCP转录因子可能参与CsLL基因的调控网络,为了进一步验证CsLL基因是否与这些TCP转录因子存在直接互作关系,我们挑选了6个TCP转录因子进行点对点酵母双杂验证,其中CsLL能够与CsTCP7（Csa5G352090）、CsTCP15（Csa1G033030）和CsTCP2（Csa V3＿1G004660）互作,并利用双分子荧光互补实验进一步验证了其互作关系。