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多元醇（糖醇）是由羰基（醛基或酮基）被还原成相应的伯羟基或仲羟基的糖类形成的醇类。D-甘露醇是一种安全的化学试剂,常用于化学生产,食品和饲料以及制药行业。D-甘露醇是一种稀有已糖醇。甘露醇脱氢酶（MtDH;EC 1.1.1.67）可以催化D-果糖和D-甘露醇之间的转化。本论文使用来源于耐热菌株的D-甘露醇脱氢酶,重点研究了D-甘露醇的酶法制备。由于D-甘露醇脱氢酶有很宽的底物谱,它可以催化D-果糖合成D-甘露醇,且没有副产物形成。本课题研究的D-甘露醇脱氢酶具有很好的耐热性,可以作为耐热的生物催化剂,在工业应用中是一个非常重要的酶。将来源于耐热菌株Caldicellulosiruptor hydrothermalis 108和Thermotoga neapolitana DSM 4359的甘露醇脱氢酶基因片段克隆后,转化到Escherichia coli BL21感受态细胞中表达。本论文通过镍离子亲和层析柱纯化得到以上两种来源的重组酶,并鉴定了其酶学性质。SDS-PAGE电泳结果显示来源于C.hydrothermalis和T.neapolitana的酶的单亚基相对分子量分别为38和36 kDa,通过液相色谱/质谱分析测定其全分子量,分别为76.7和135 kDa。结果表明,来源于C.hydrothermalis的甘露醇脱氢酶为同源二聚体,而来源于T.neapolitana的甘露醇脱氢酶为四聚体。来源于C.hydrothermalis和T.neapolitana甘露醇脱氢酶的最适温度分别为60°C和90°C,最适pH分别为7.0和6.5。C.hydrothermalis MtDH在55,60,65和70oC条件下保温4 h,分别维持80%,75%,60%和10%的残余酶活。但T.neapolitana MtDH表现出很好的耐热性,在75℃条件下非常稳定,在90℃保温1h后仍然可以维持50%的酶活力。以果糖为底物时,C.hydrothermalisMtDH的Km,kcat和kcat/Km值分别是6 mM,37.25 s1和6.2 mM-11 s-1;T.neapolitanaMtDH的Km,Vmax,Kcat和kcat/Km分别是20 mM,200 U mg-1,180s-1和9 mM-1 s-1。使用全细胞将D型糖生物转化成其他糖是一种很好的方法。因此可以将来自耐热菌C.hydrothermalis的甘露醇脱氢酶（MtDH）和来自Ogataea parapolymorpha的甲酸脱氢酶（FDH）共表达,构建生物合成D-甘露醇的多酶偶联系统。使用来自O.parapolymorpha的甲酸脱氢酶构建辅酶再生体系持续提供NADH。重组后的Escherichia coli可以从0.5%果糖生产得到最大产量约为41mg/m L的D-甘露醇。结果表明,当使用更高浓度1%和2%的果糖时,D-甘露醇产率与底物浓度成反比。反应体系的最适pH为7.0,最适温度为60oC。E.coli共表达体系是一种非常有效的产甘露醇的生物催化系统,可以在较高的温度和稳定的pH条件下得到较高产量的D-甘露醇,并且无其他副产物糖生成。使用Swiss在线模拟软件对C.hydrothermalis MtDH和T.neapolitana MtDH的三维结构进行同源性建模。使用AutoDock Vina5.6软件模拟对接D-甘露糖醇的三维蛋白模型。同源性建模和对接研究结果表明,对于C.hydrothermalis MtDH,直接参与MtDH的化学反应的保守残基分别为Asp205,Arg203,Glu187,Lys188,Asp189和Glu190。而对于T.neapolitana MtDH,三个催化残基Asn86,Leu109和Asp82通过氢键与D-甘露醇直接接触。D-甘露醇与C.hydrothermalis MtDH有着很强相互作用,呈现-0.27的网格评分,而T.neapolitana MtDH的网格评分为-0.29,表明化学结合的相互作用很强。