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由落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina Kleb.)引起的杨树叶锈病,是一种远距离传播、转主寄生性真菌病害,已在全球杨树种植区造成大量经济损失。选育持久抗叶锈病杨树品种是防治和减少该病害最经济、有效、安全和可持续的方法。然而,由于松-杨栅锈具有生活史复杂、变异快速及新小种不断产生等特点,大大减慢和限制了杨树抗病品种的选育进程。因此,了解杨树-叶锈菌互作中的基因表达特征,尤其是克隆并分析防卫反应相关基因的特性及功能,能为研究杨树-叶锈菌互作寄主防卫反应及抗病机制奠定基础,为选育抗锈病杨树品种提供理论基础和技术依据。本研究以川杨和松-杨栅锈菌Sb052菌系非亲和互作的寄主叶片为材料,利用抑制性差减杂交技术(SSH)构建ESTs文库。通过RACE技术克隆防卫相关基因,结合生物信息学方法分析各基因基本特性及功能,并进一步对防卫相关基因在川杨-叶锈菌互作中的时空动态表达模式进行了分析。主要研究结果如下:1.构建了接种叶锈菌无毒菌系Sb052后0.5、1、2、3和4 dpi混合的川杨叶片SSH-c DNA文库。对文库中515个克隆进行测序,聚类分析后获得141个unigenes,包括66个contigs和75个singletons。功能注释分析发现,已知功能的unigenes中,基础代谢类最多,占30%,其次有24%参与细胞生理过程,10%与胁迫响应相关,而与信号转导、定位、免疫反应、生物调控、发育及死亡等相关的unigenes占19%。分析文库中获得的与寄主抗病性相关基因,结果显示,拷贝数最多的(含41条)ESTs序列编码1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶。其次为核酸结合位点(NBS)类抗病基因,含有18个拷贝,β-1,3-葡聚糖酶(Gns)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因亦分别含有13和10个拷贝。此外,还含有病程相关蛋白1(PR1)、类甜蛋白(TLP)、ABC转运子等防卫反应相关基因。推测这些基因参与川杨的防卫反应,在川杨的抗锈病与防卫反应中有重要作用。2.以本研究所构建SSH-c DNA文库中川杨病程相关蛋白1(Ps PR1)、β-1,3-葡聚糖酶(Ps Gns)、类甜蛋白(Ps TLP)及苯丙氨酸解氨酶(Ps PAL)基因的ESTs序列为靶序列,利用RACE技术克隆这些基因。获得的Ps PR1、Ps Gns、Ps TLP1、Ps TLP2、Ps PAL基因c DNA全长序列分别为728、1189、929、885和2586 bp。Ps PR1、Ps Gns、Ps TLPs基因编码的病程相关蛋白均含有典型的信号肽,在杨属(Populus)中比较保守。Ps PR1、Ps Gns、Ps TLPs和Ps PAL基因编码的预测蛋白分别属于SCP、Glyco-hydro-17、GH64-TLP-SF和Lyase_I_like超级家族,其中的SCP、GH64-TLP-SF和Lyase_I_like家族分别含有CAP、TLP-PA与THN和PAL-HAL等功能结构域。3.RT-q PCR技术分析Ps PR1、Ps Gns、Ps TLP1、Ps TLP2和Ps PAL基因及病程相关基因非表达子1(NPR1)、ABC转运子基因在川杨-叶锈菌互作中的时空动态表达模式。结果显示,各基因表达量受叶锈菌诱导在0.5 dpi就有所上调,且非亲和组合中的升高幅度一般高于亲和组合。非亲和组合中,大部分Ps DR基因在叶片中的表达量分别于0.5或2、4或7 dpi出现两个高峰;Ps PR1、Ps TLP2、Ps PAL、NPR1与ABC转运子基因的表达量在川杨叶柄组织中上调最显著,其次为顶芽中,而在根部组织中表达量很低甚至检测不到。4.克隆了川杨4个过氧化物还原酶(Ps Prx)基因,Ps1Cys Prx、Ps2Cys Prx、Ps Prx Q和Ps Prx II基因c DNA全长序列分别为930、1150、975和853 bp。各Ps Prx基因编码的预测蛋白均属于硫氧还原蛋白超级家族,并含有不同类型Ps Prx的结构功能位点,如具有氧化或还原活性的半胱氨酸残基。不同类型Ps Prx所包含的保守结构域不同,如PVCTTE、PXXXTXXC和CXXC等。推测Ps Prx基因可能参与川杨抵御病原真菌侵染中的氧化还原信号转导途径。5.受叶锈菌无毒菌系Sb052诱导后,各Ps Prx基因的表达量在川杨叶片中相对最高,其次是相邻叶片、根部及顶芽组织。非亲和组合川杨叶片接种1~7 dpi各Ps Prx基因相对表达量明显上调,并出现两次高峰,且上调幅度高于亲和组合叶片。