【摘 要】
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目的:阐明肿瘤坏死因子α诱导蛋白 8样蛋白 3（tumor necrosis factor-alpha-induced protein 8-like 3,TIPE3）介导上调 EphA2 和磷酸化 EphA2（Ser897,S897）在肝细胞癌（HCC）恶性进展中的作用及其分子机制。方法:（1）收集HCC患者癌和癌旁（对照）组织标本及临床病理资料,免疫组化检测HCC癌组织中TIPE3的表达水平,并
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目的:阐明肿瘤坏死因子α诱导蛋白 8样蛋白 3（tumor necrosis factor-alpha-induced protein 8-like 3,TIPE3）介导上调 EphA2 和磷酸化 EphA2（Ser897,S897）在肝细胞癌（HCC）恶性进展中的作用及其分子机制。方法:（1）收集HCC患者癌和癌旁（对照）组织标本及临床病理资料,免疫组化检测HCC癌组织中TIPE3的表达水平,并分析与各临床病理参数之间的关系。（2）提取 HCC 细胞 SMMC7721、MHCC97H、MHCC97L、HepG2、HuH7、LM3、SK-HEP-1和正常肝细胞L02（对照）的总蛋白,运用Western blot方法检测TIPE3在HCC细胞中的表达。（3）制备TIPE3过表达、TIPE3 shRNA干扰慢病毒及其对照病毒载体。（4）建立 TIPE3 过表达（MHCC97L-TIPE3 vs MHCC97L-mock、MHCC97H-TIPE3 vs MHCC97H-mock）和 TIPE3 敲减（MHCC97H-shTIPE3 vs MHCC97H-shcontrol、LM3-shTIPE3 vs LM3-shcontrol）HCC细胞稳转株,并分别使用荧光显微镜、流式细胞术检测GFP;Western blot、RT-qPCR检测TIPE3对其进行鉴定。（5）通过CCK-8、平板克隆形成、EdU、划痕、Transwell侵袭实验,于细胞模型上分析TIPE3对HCC细胞生长增殖、克隆形成、迁移和侵袭的影响。（6）建立BALB/c裸鼠HCC皮下移植瘤模型,通过监测肿瘤的体积和重量,于动物模型上分析TIPE3对HCC细胞体内成瘤能力的影响。（7）在TIPE3过表达、敲减组HCC细胞中采用Western blot和RT-qPCR检测TIPE3对HCC细胞EphA2表达和p-EphA2（S897）水平的影响。（8）在TIPE3过表达MHCC97L-TIPE3 HCC细胞中开展EphA2敲减功能实验,探究沉默EphA2能否削弱TIPE3促进HCC细胞生长和转移的作用。（9）在TIPE3过表达、敲减组HCC细胞中采用Western blot检测MEK-ERK、PI3K-AKT信号通路相关分子的水平,分析TIPE3对HCC细胞MEK-ERK、PI3K-AKT信号活化的影响。（10）在TIPE3过表达MHCC97L-TIPE3 HCC细胞中开展MEK、PI3K抑制实验,分析MEK-ERK、PI3K-AKT通路在TIPE3介导上调HCC细胞EphA2、p-EphA2（S897）中的作用。结果:（1）TIPE3在HCC癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织,HCC癌组织中TIPE3的表达水平与肿瘤大小、病理分期呈正相关。（2）与正常肝细胞相比,HCC细胞中TIPE3的表达水平上调。（3）成功建立了 TIPE3稳定过表达HCC细胞株及其对照细胞 MHCC97L-TIPE3 vs MHCC97L-mock、MHCC97H-TIPE3 vs MHCC97H-mock 和 TIPE3 敲减 HCC 细胞株及其对照细胞 MHCC97H-shTIPE3 vs MHCC97H-shcontrol、LM3-shTIPE3 vs LM3-shcontrol。（4）TIPE3 过表达能明显促进MHCC97L和MHCC97H HCC细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭,以及体内生长成瘤能力;而在MHCC97H和LM3 HCC细胞中,敲减TIPE3起到相反的效应。（5）TIPE3能够上调HCC细胞EphA2、p-EphA2（S897）的水平,其在TIPE3促进HCC生长、转移恶性生物学行为中扮演重要角色。（6）在HCC细胞中,TIPE3介导的EphA2/p-EphA2（S897）上调与MEK-ERK、PI3K-AKT信号通路的激活有关。结论:TIPE3在HCC中表达升高,并且可促进HCC细胞的生长和转移。TIPE3很可能通过激活MEK-ERK、PI3K-AKT途径上调EphA2/p-EphA2（S897）的表达水平,进而重要参与HCC的恶性进展。
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