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背景与目的:舌癌是最常见的口腔颌面部恶性肿瘤,临床常规采用手术并辅以化疗或放疗的综合治疗方法。由于化疗存在耐药且其机制未予阐明,舌癌的治疗效果一直不太理想。本研究将围绕课题组前期从舌癌多药耐药细胞(Tca8113/pym)中克隆的舌癌耐药相关基因TCRP1的功能开展相关研究,为进一步阐述舌癌化疗耐受机制,逆转舌癌耐药,提高舌癌临床化疗效果提供新的证据。
方法:(1)构建TCRP1真核表达载体,转染舌癌耐药亲代细胞Tca8113,筛选并挑取单克隆,建立TCRP1稳定表达细胞系(Tca8113/TCRP1);(2)MTT方法检测Tca8113/TCRP1细胞对平阳霉素(Pingyangmycin,PYM)、顺铂(Cisplatin、cDDP)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil、5-Fu)、阿霉素(Adriamycin、ADM)、吡喃阿霉素(THP)等6种舌癌常用药物的敏感性,计算各药物的IC50值,筛选TCRP1介导的耐受药物;(3)针对TCRP1mRNA序列设计干扰片段,构建干扰表达质粒(pAU6+27/TCRP1-i),瞬时转染TCRP1内源性高表达细胞舌癌耐药株(Tca8113/PYM),观察干扰前后细胞对上述药物敏感性的差异;同时通过G418选择建立TCRP1表达稳定沉默的细胞系(Tca8113/PYM-i);(4)采用MTT、平板克隆、软琼脂克隆实验观察Tca8113、Tca8113/v、Tca8113/TCRP1、Tca8113/pym、Tca8113/pym-i、Tca8113/pym-v等6株细胞的生长速度及对TCRP1功能相关药物顺铂的敏感性;(5)Hochest 33258染色、流式细胞计数、DNA ladder、及Western Blot等方法检测上述各组细胞药物诱导后的凋亡状况。
结果:(1)TCRP1外源性高表达Tea8113/TCRP1细胞对cDDP和PYM的耐受性明显增高,耐药指数分别是对照细胞的2.2倍和1.7倍(P<0.05);但对5-Fu、ADM、VP-16、THP、的耐药性无明显改变;(2)TCRP1表达沉默细胞(Tca8113/pym-i)对cDDP的敏感性较沉默前细胞Tca8113/pym增加1.5倍(P<0.05),而对包括PYM在内的其他药物的敏感性均无变化;(3)上述六组细胞的生长增殖速度无明显差异;(4)经顺铂处理后,Tca8113/TCRP1、Tca8113/PYM平板克隆形成的集落数分别为对照组的2.2和2.9倍;软琼脂克隆形成的集落数分别为对照组细胞的2.9和3.1倍(P<0.05);TCRP1稳定沉默的Tea8113/PYM-i细胞比载体对照组细胞(Tca8113/PYM-v)分别降低2.2和1.4倍;(5)顺铂诱导后,Tca8113/TCRP1、Tca8113/pym细胞凋亡数较各自对照细胞(Tca8113/v、Tca8113/pym-v)降低,DNALadder电泳带形成不明显,Caspase-3表达降低,而Tca8113/pym-i细胞的上述各项指标较对照组细胞Tca8113/pym-v均升高。
结论:(1)TCRP1能特异性介导舌癌细胞对顺铂的耐受,仅在表达水平较高同时介导对平阳霉素的耐受,而与5-Fu、ADM、VP-16、THP敏感性无明显差异;(2)TCRP1介导的对顺铂的药物耐受与其能增强舌癌细胞对cDDP诱导的凋亡抗性有关。