禽霍乱（Fowl Cholera）是一种发病率和死亡率高的急性全身性疾病,给家禽养殖业造成巨大经济损失。其病原是禽多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）,属于革兰氏阴性菌。早前,我国鸡场对禽霍乱防控主要依赖于抗生素。随着细菌耐药性问题日益突出,以及今年我国禁抗限抗全面实施,生物防制将在预防禽霍乱中起着重要作用。但目前的灭活疫苗不能产生免疫交叉保护力,传统弱毒疫苗存在毒力返强的风险,因此开发安全有效的新型疫苗迫在眉睫。本论文采用NgAgo遗传操作系统,以禽多杀性巴氏杆菌GX-PM为亲本株,成功构建了3株无分子标记基因缺失突变株,包括ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM,并对这3株基因缺失突变株体外生长及形态特性、遗传稳定性、致病性及免疫保护效力进行研究分析。具体研究内容及结果如下:1.基因缺失突变株构建首先,本研究成功构建了用于敲除aroA、hexD和hex ABC基因的重组质粒p SHK5（TS）-NgAgo-aroALR、p SHK5（TS）-NgAgo-hexDLR和p SHK5（TS）-NgAgo--hex ABCLR,后分别电转入GX-PM中,将电转菌经过多次传代诱导缺失,最后成功筛选到3株无分子标记基因缺失突变株,分别为ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM。2.基因缺失突变株体外生长及形态特性研究为了分析aroA、hexD和hex ABC基因缺失后对细菌体外生长特性影响,本研究对ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM进行生长曲线测定。结果表明:在体外培养条件下,与GX-PM野生株相比,ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株生长速度均减慢,且ΔaroA-GX-PM突变株在不含芳香族氨基酸条件下无法生长。为了分析荚膜转运基因hexD和hex ABC基因缺失后对细菌荚膜形态的影响,本研究对ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株进行透射电镜观察。结果表明:在体外培养条件下,与具有荚膜的GX-PM野生株相比,ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株细胞壁表面无正常荚膜形态,说明其合成荚膜能力基本丧失。3.基因缺失突变株体外遗传稳定性研究本研究将ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株在液体培养基上连续传代30次,通过PCR检测靶基因是否稳定缺失来分析其遗传稳定性。结果表明:ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株在30代以内均未发生回复突变,具有良好遗传稳定性。4.基因缺失突变株致病性研究为了研究ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株对鸡的致病性,本研究通过肌肉注射不同剂量（10³、10⁵、10⁷、10⁸、10⁹ CFU）突变株对30日龄健康肉鸡进行人工感染,连续观察14d并记录临床症状及死亡情况。结果表明,用10² CFU野生菌人工感染时,肉鸡24h内死亡率为100%（n=4）,而ΔaroA-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株不同剂量感染组肉鸡均未表现明显临床症状也无死亡情况;ΔhexD-GX-PM突变株感染剂量10⁹和10⁸ CFU组肉鸡死亡率分别为75%和25%,其余剂量组均未出现死亡情况,且部分存活肉鸡先出现临床症状后期逐渐恢复健康。试验结果说明:与GX-PM野生株相比,ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株对鸡的致病性均显著下降。5.基因缺失突变株免疫效力研究由于ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株对鸡的致病性均显著降低,有作为基因缺失弱毒疫苗研发的潜力,所以本文对ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM免疫效力进行研究。本研究使用不同剂量（10⁷、10⁸和10⁹ CFU）的ΔaroA-GX-PM突变株对30日龄健康肉鸡通过肌肉注射进行免疫接种,在免疫后第14d,使用10³ CFU的GX-PM野生株对肉鸡进行人工感染,试验结果表明:GX-PM野生株感染后,PBS感染对照组肉鸡在24h内全部死亡（n=4）,ΔaroA-GX-PM突变株免疫组肉鸡未出现死亡情况,免疫保护率均为100%;同样地,使用不同剂量（10⁷、10⁸和10⁹ CFU）的Δhex ABC-GX-PM突变株对30日龄健康肉鸡进行免疫接种,在免疫后第14d,使用10³ CFU的GX-PM野生株对肉鸡进行感染,试验结果表明:Δhex ABC-GX-PM突变株免疫剂量10⁷、10⁸和10⁹ CFU组免疫保护率为分别为0、0和25%;使用剂量为10⁷和10⁸ CFU的ΔhexD-GX-PM突变株对30日龄健康肉鸡进行免疫接种,在免疫后第14d,用10³ CFU的GX-PM野生株对肉鸡进行人工感染,试验结果表明:ΔhexD-GX-PM突变株免疫剂量10⁷、10⁸ CFU组免疫保护率分别为0和25%。为了进一步研究ΔaroA-GX-PM突变株对鸡的免疫保护效力,将ΔaroA-GX-PM基因缺失株组肌肉注射10⁸ CFU的菌液进行接种免疫,同时设置PBS攻毒对照组和PBS空白对照组（n=10）。在免疫后第14d,用剂量为20 LD₅₀的GX-PM野生株以肌肉注射的方式对ΔaroA-GX-PM免疫组和PBS攻毒对照组进行人工感染。免疫保护率结果表明:PBS攻毒对照组肉鸡在24h内死亡率为100%,而ΔaroA-GX-PM突变株免疫组肉鸡全部存活,免疫保护率为100%。分别采集免疫后第14d和21d的鸡血清（n=4）,测定血清中Ig G抗体水平。结果表明:与未免疫组相比,免疫后第14d和21d,免疫组的鸡血清中均检测到较高水平的Ig G抗体,且差异显著（P<0.01）,说明ΔaroA-GX-PM突变株能够诱导鸡产生较强的体液免疫,具有较好的免疫原性。以上结果说明:ΔaroA-GX-PM突变株对鸡能产生较高免疫效力,而ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株对鸡基本无免疫保护力。综上所述,本研究采用NgAgo遗传操作系统,成功构建了3株无分子标记、遗传稳定的基因缺失突变株,分别为ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM。通过对鸡的致病性试验和免疫保护试验发现,ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM对鸡的致病性均显著下降。其中ΔaroA-GX-PM突变株具有较好免疫原性,能够刺激机体产生免疫反应,对鸡免疫保护率达100%,可作为禽多杀性巴氏杆菌基因缺失弱毒疫苗候选株。