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富马酸在医药、食品及工业等领域有着广泛的用途。但现有的化学合成工艺获得富马酸产品,由于安全性受到质疑,限制了其在医药以及食品饲料添加剂等领域的进一步应用。因此,开发绿色、安全及可持续的富马酸制备技术,实现富马酸生产原料从石油向生物质转变,将有助于加快我国富马酸产业结构的调整。然而,利用生物质发酵制备富马酸的研究虽已有百年历史,但当前还主要集中在生产菌种诱变选育以及基因改造等方面的研究,针对富马酸生物合成工艺过程的研究还处于初级阶段,使得目前生物合成富马酸存在“生产成本高”以及“能耗高”等问题,这主要体现在发酵过程中糖耗速率慢、生产强度低等现象,导致生物合成富马酸的工业化生产仍面临诸多困难。微生物在代谢过程中除物质代谢外,还需能量代谢的参与,如ATP/ADP,NADH/NAD,故对胞内能荷代谢的调控亦是对微生物代谢调控。 本课题组在米根霉发酵富马酸过程中发现了交替呼吸途径的存在,并对该途径与富马酸积累的关联性以及关键酶—交替氧化酶及其调控方式进行了研究,结果发现发酵期间交替呼吸强度和产物积累速率在同一时刻达到最大值。然而,交替呼吸强度如何影响米根霉合成富马酸,鲜有文献报道。在此基础上,本文主要探讨了米根霉合成富马酸代谢过程中能量代谢与产物代谢之间的关系,探索了两者之间在发酵过程中的适配性,为从根本上提高米根霉合成富马酸的生产强度提供理论基础,具体工作如下: (1)考察了不同溶氧对1000L罐分批发酵生产富马酸的影响,并通过对不同溶氧条件下标准呼吸与交替呼吸变化趋势和规律的分析,探讨了发酵过程中两条呼吸途径与富马酸合成之间的关系。研究发现,当溶氧浓度太高(80%)或太低(30%)均不利于富马酸的合成,在溶氧浓度80%条件下,糖耗以及富马酸生产强度均较低;在溶氧浓度30%条件下,虽然糖耗以及富马酸生产强度有所提高,但乙醇浓度较高,富马酸产量较低。分析两条呼吸途径在发酵过程中的变化发现,在发酵前期,不同溶氧条件下交替呼吸强度都较低,随着发酵的进行,交替呼吸呈现逐渐增强趋势,但低溶氧条件下,交替呼吸增长速度较快,而不同溶氧条件下,标准呼吸的变化与交替呼吸呈现相反的变化趋势。该结果进一步论证了交替呼吸以及标准呼吸强度的变化,对糖耗以及富马酸的生产强度具有影响。 (2)以米根霉F-14为出发菌株,通过采用通气流量10slm,照射距离2mm,电功率100W的ARTP离子机进行物理诱变,诱变时间60s,在含有0.6g/L的SHAM的选择性PDA固体培养基平板上,筛选出敏感性突变株。在这些突变菌株中,交替呼吸初始强度均较出发株F-14提升了1倍以上,达到了总呼吸强度的32-52%,其中突变菌株S-1的初始交替呼吸强度达到了总呼吸的52%左右,是出发菌株3.5倍,然而富马酸的发酵浓度与出发菌株相比反而有所下降,富马酸产量与出发菌株相比下降了近36%。 (3)进一步考察了突变株S-1和出发株F-14菌株在发酵过程中交替呼吸及富马酸生产强度,总呼吸变化和还原力NADH/NAD+的变化;结果表明突变株在富马酸发酵初始阶段过高的交替呼吸强度反而降低了富马酸的生产速率,并导致了发酵后期菌体的早衰现象。交替呼吸强度与发酵进程存在适配性,只有当适配性达到最佳状态时,才有利于产物的高效积累。