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本研究首先从鲢鱼卵提取总RNA,通过RT-PCR后得单链cDNA,再以Cystatin F:5’-TAGGATCCACTGGGATTCCTGGAGGCCTTGTA-3’, Cystatin R: 5’-CCCTCGAGCATGCAGGTGTTTTCAGTGAC-3’为引物,经PCR扩增得到333bp大小的鲢鱼卵Cystatin(家族Ⅱ)基因片段,再经Cystatin-pMD19-T重组质粒的克隆,将菌落PCR鉴定为阳性的单克隆进行测序分析,结果表明由该基因片段碱基推导的氨基酸序列,含有典型的Cystatin(家族Ⅱ)保守结构域：G (5)、QVAAG (49-53)、PW(98,99)。此后经Bam HI和Xho Ⅰ双酶切及连接反应,构建原核表达载体Cystatin-pET-32a,并将其转化至感受态E.coliDH5a,经菌落PCR检测和双酶切鉴定正确后,将该原核表达载体转入感受态E.coliBL21(DE3),并于诱导剂1mmol/L的IPTG,30℃,3h的最适诱导条件下,成功表达了包涵体形式的融合蛋白trx-Cystatin。表达菌体沉淀经超声破碎后,离心分离得到的包涵体蛋白,经0.5mol/L、1mol/L、5mol/L尿素分步洗涤后,取8mol/L尿素洗涤收集液,透析后用镍亲和层析纯化得到融合蛋白trx-Cystatin,经肠激酶以1U/mg trx-Cystatin的量,37℃水解16h后,样品再通过SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析,在NaCl浓度为0.2mol/L时洗脱得到目的蛋白Cystatin,在SDS-PAGE上呈现约15.8kD的单一条带。进一步以荧光合成肽底物法测定重组鲢鱼C ystatin对木瓜蛋白酶、组织蛋白酶B、L的抑制活性,pH稳定性和热稳定性,抑制类型和常数Ki。结果：重组Cystatin可耐受较宽的pH, pH4.0-9.0范围内稳定,pH10.0-13.0时,活性明显下降；重组Cystatin在4℃-60℃内稳定,60℃以上时活性明显下降；对木瓜蛋白酶属于竞争性抑制剂,抑制常数Ki为0.0008nmol。最后将重组Cystatin添加到鲢鱼鱼糜中,研究其对鱼糜凝胶软化的抑制作用。实验组中重组Cystatin入量为30μg/g鱼糜及60μg/g鱼糜,对照组中添加了等质量的超纯水的对照组,60μg/g鱼糜和对照组鱼糜凝胶破断力分别为330.66g±11.28g和197.75g±15.38g,实验组极显著增加67.21%(p<0.01),鱼糜凝胶强度分别342.80g·cm±28.01g·cm和150.10g·cm±16.75g·cm,实验组显著增加1.28倍,持水率分别为91.63%±0.51%和90.49%±0.56%,实验组增加1.25%(0.01<p<0.05),白度分别为43.09±0.46和42.37±0.36,实验组增加1.69%(0.01<p<0.05),30μg/g鱼糜组各项指标也显著(0.01<p<0.05)或极显著(p<0.01)高于对照组,但低于60μg/g鱼糜组,且除持水率外均差异不显著(p>0.05)。此外,通过SDS-PAGE观察并定量分析了鱼糜凝胶中肌球蛋白重链水解程度,结果表明,30μg/g和60μg/g的实验组肌球蛋白重链水解分别减轻15.79%和17.89%。同时,利用扫描电镜观察鱼糜凝胶的微观结构,表明与对照组比,两实验组凝胶表面更光滑,结构致密,网络结构排列均匀。上述结果,表明通过添加鲢鱼自身的重组Cystatin可显著抑制鲢鱼鱼糜凝胶软化。