Alport综合征（AS）、薄基底膜肾病（TBMN）和家族性局灶节段性肾小球硬化（FFSGS）是最常见的遗传性肾小球疾病。Ⅳ型胶原（Collagen Type Ⅳ,COL4）的突变是其重要发病机制,其中AS和TBMN已明确由足细胞的Ⅳ型胶原α3/α4/α5链（COL4A3/COL4A4/COL4A5,COL4A3-5）突变引起。多项研究也显示COL4A3/COL4A4为FFSGS的新致病基因。但目前鉴定到的突变位点尚少,且机制尚未完全阐明。因此寻找引起遗传性肾小球疾病相关的Ⅳ型胶原（COL4A3-5）新突变位点及对探索足细胞损伤的发病分子机制有重要意义,为将来寻找新的治疗措施提供理论依据。在前期工作基础上,本研究对45个FSGS家系及77例伴有基底膜改变的散发FSGS（SFSGS）患者进行全外显子测序及进一步Sanger测序验证,我们发现了 9个新的COL4A3-5突变位点。在6个FSGS家系中找到了 3个COL4A5错义突变（p.G159V、p.G603D 和 p.K474N）,2 个COL4A3 错义突变（p.I1264T 和 p.G991E）,和 1 个COL4A4错义突变（p.G71R）。在 3 例 SFSGS 患者中发现了COL4A3p.I696M;COL4A4 p.A1577E和p.G199R突变。我们进一步收集合并肾小球基底膜（GBM）病变的FSGS患者及TBMN患者的临床资料及预后进行分析,以最低GBM厚度≤250nm作为区分标准,将FSGS组分为GBM有局部变薄组（A组-97例）和GBM无局部变薄组（B组-51例）。结果显示,与B组比较,A组患者女性显著多于男性,收缩压、血肌酐、肾脏病理局灶节段硬化比例3方面A组相对病情轻,其他临床特征未见显著差异。与TBMN组（33例）比较,FSGS伴GBM局部变薄组患者的临床表现更重。结合既往工作基础,我们首次提出建议将COL4A3/A4/A5突变引起的肾病（TBMN、良性家族性血尿、AS及FSGS）统一归入Ⅳ型胶原相关肾病的范畴,将临床诊断与突变基因分子诊断相结合。为探索足细胞COL4A3突变引发肾小球疾病可能的分子机制,本研究第二部分应用慢病毒载体构建人足细胞系过表达COL4A3野生型（WT）和4个突变型（包括COL4A3 G619R、G801R、C1616Y 错义点突变及 COL4A3 p.Leu1528 stop 终止突变）的稳定转染细胞系,荧光定量PCR显示各组COL4A3 mRNA显著升高,Westernblot（WB）分析足细胞和细胞外上清显示WT、G619R、G801R和C1616Y组COL4A3显著高表达,但p.Leu1528 stop组蛋白表达量明显低于前述4组。我们进一步将各组行mRNA-seq表达谱分析,结果显示p.Leu1528 stop组与WT组mRNA基因表达差异明显,其它3组表达谱与WT组差异明显较小。结合mRNA-seq结果,进一步行荧光定量PCR发现C1616Y和p.Leu1528 stop组MCP-1 mRNA表达水平显著高于WT组,ELISA检测细胞外上清示p.Leu1528 stop组MCP-1分泌水平显著升高。我们通过荧光定量PCR检测发现在C1616Y和p.Leu1528 stop组内质网应激（ERS）相关基因CHOP、sXBP-1的mRNA表达显著升高,WB结果显示p.Leu1528 stop组ERS相关 PERK、GRP94、GRP78、eIF2α 蛋白表达显著升高,凋亡相关 cleaved-caspase3、CHOP、Bax 表达升高,Bcl2 表达下降,其中 PERK、eIF2α、CHOP、Bax 在 C1616Y组也有升高。我们发现应用蛋白酶体途径抑制剂（MG132）可显著提高p.Leu1528 stop组COL4A3的表达,而在WT组无明显改变,这提示对蛋白酶体途径的干预可能成为COL4A3严重突变（如蛋白翻译提前终止）新的治疗手段。下一步我们利用CRISPR/Cas9系统建立在DNA水平的mus-Col4a3敲除小鼠单克隆足细胞系,成功构建了 Col4a3p.Gly95stop和Col4a3p.Thr1621Stop两个细胞系。与WT组比较,WB显示Col4a3蛋白表达不明显,荧光定量PCR显示CHOP、sXBP-1、MCP-1的表达升高。流式检测发现Col4a3 p.Thr1621Stop较WT组细胞凋亡显著增加。Col4a3 p.Gly95stop 和 p.Thr1621Stop 组细胞 WB 检测 PERK、GRP94、eIF2α 表达均显著升高,p.Gly95stop组C-Caspase3、CHOP、Bax、Bcl-2蛋白表达上调,显示凋亡明显增加。本部分研究在体外细胞水平证实ERS及过度ERS诱发的凋亡参与了 COL4A3致病突变（特别是严重突变如蛋白翻译提前终止）引起足细胞损伤的分子机制,而且提示对蛋白酶体途径的干预可能成为COL4A3严重突变新的治疗手段。为评价COL4A3突变体内致病效应,我们进一步构建转基因小鼠模型,获得了Col4a3p.Arg1631Stop转基因小鼠模型。在纯合组（Hom）小鼠6周开始观察到明显蛋白尿和血尿,12周开始血肌酐明显升高,光镜示典型FSGS改变及肾小球硬化,电镜示GBM局部明显增厚。20周Hom小鼠在肾功能、肾脏病理和电镜病变较12周更为加重,且在高倍电镜下观察到明显的自噬小体增多。20周Het小鼠我们并未观察明显的血尿和蛋白尿,在32周龄杂合（Het）小鼠（2雄2雌）肾脏病理光镜亦显示FSGS改变,电镜显示GBM有局部增厚及变薄,足突局部融合。我们将12周WT/Het/Hom组小鼠肾皮质组织送mRNA-seq分析差异基因,结果显示ERS相关基因及信号通路改变,与之前细胞研究一致。荧光定量PCR进一步验证差异基因,结果显示12周和20周的Hom小鼠MCP-1、Colla1较WT/Het组表达均显著升高,ERS相关的Chop、Bip、sXbp1在mRNA水平各组间无显著差异。各组小鼠肾皮质组织提取总蛋白进行WB分析,与WT/Het组比较,Hom组小鼠（12周和20周）均显示了 ERS相关蛋白GRP78、PERK和IRE1α的表达显著升高,凋亡相关蛋白Chop和Bax,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和炎症相关蛋白MCP-1均显著升高,此外12周Hom小鼠Atg16L1和p-eIF2α表达明显升高。但在Het组小鼠均未观察到上述指标的显著改变,与其肾脏无明显表型一致。本部分研究在体内水平证实过度ERS、凋亡及自噬分子机制参与了 COL4A3突变引起的肾脏病表型。综上所述,我们通过扩大对FFSGS及SFSGS患者的COL4突变检测,发现了 9个新的COL4A3-5突变位点。结合既往工作,首次提出建议将COL4A3/A4/A5突变引起的肾病统一归入Ⅳ型胶原相关肾病的范畴;应用慢病毒及CRISPR/Cas9系统构建不同COL4A3突变足细胞模型,发现过度ERS及凋亡引起足细胞损伤的分子机制,蛋白酶体途径干预可能为COL4A3严重突变（如蛋白翻译提前终止）新治疗手段;此外我们建立了新的Col4a3 p.Arg1631Stop转基因小鼠模型,在Hom组观察到明显的肾脏病表型,进一步分子机制探索显示过度ERS、凋亡和自噬参与了 COL4A3突变的致病效应,为今后进一步研究奠定了很好的模型和工作基础。