【摘 要】
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目的:揭示GSDMD蛋白在结直肠癌中表达模式与临床病理相关指标的关系,探究GSDMD亚细胞定位在结直肠癌发生和进展中的功能与机制。方法:通过配对结直肠癌组织芯片的免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）技术,分析GSDMD表达模式及其与临床病理指标的关联。采用CCK8与裸鼠皮下成瘤技术检测GSDMD对肿瘤细胞生长的影响;应用免疫荧光（immunofluorescence,I
【基金项目】
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国家自然科学基金（NSFC81530044）；
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目的:揭示GSDMD蛋白在结直肠癌中表达模式与临床病理相关指标的关系,探究GSDMD亚细胞定位在结直肠癌发生和进展中的功能与机制。方法:通过配对结直肠癌组织芯片的免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）技术,分析GSDMD表达模式及其与临床病理指标的关联。采用CCK8与裸鼠皮下成瘤技术检测GSDMD对肿瘤细胞生长的影响;应用免疫荧光（immunofluorescence,IF）技术观测GSDMD蛋白在缺氧时亚细胞定位;应用流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测GSDMD稳转细胞株在化疗药物处理时凋亡变化;检测GSDMD蛋白在奥沙利铂处理时是否被切割;应用质谱鉴定GSDMD相互作用蛋白,并用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,co-IP）技术进行验证;应用IF检测GSDMD与PARP-1在奥沙利铂处理时亚细胞定位变化;检测GSDMD对PARP-1功能,即对底物PAR化的影响;应用IF检测GSDMD对奥沙利铂诱导DNA Damage标志物γ-H2AX Foci的影响;通过截断体co-IP鉴定GSDMD与PARP-1相互作用的结构域,并用PARP抑制剂Olaparib处理细胞的co-IP与FCM检测凋亡验证;应用IF检测不同化疗药及ATM/ATR抑制剂对GSDMD核易位的影响,并用ATM抑制剂处理细胞的核质分离与FCM检测凋亡验证;应用IHC检测芯片中p-ATM表达,与核定位GSDMD表达进行相关性分析;应用MC38 m Gsdmd过表达稳转细胞株于C57BL/6小鼠皮下注射成瘤,观测奥沙利铂处理后各组肿瘤体积差异,并对瘤块进行IHC分析。结果:结直肠癌组织芯片IHC结果示GSDMD在癌组织中较对应癌旁组织低表达。以癌组织中GSDMD的表达高低分组,患者的生存预后没有明显统计学差异,但是GSDMD表达核阳性显示良好预后,核阴性显示不良预后。CCK8检测提示在体外GSDMD对肿瘤细胞生长无明显影响,裸鼠皮下成瘤提示GSDMD在体内抑制细胞生长,IF结果显示缺氧能引起轻中度的GSDMD入核。FCM检测显示GSDMD过表达促进由奥沙利铂与5-Fu诱导的凋亡,CCK8检测显示RKO细胞在奥沙利铂处理下,GSDMD过表达抑制细胞活性,敲低促进细胞活性。Western blot结果显示肿瘤细胞中GSDMD在奥沙利铂处理时不被切割。质谱结果显示GSDMD与PARP-1相互作用并用半内源与内源性co-IP验证。进一步半内源与内源性IF结果示稳态时GSDMD主要定位于细胞质,在奥沙利铂刺激时GSDMD入核,与核蛋白PARP-1形成共分布。在奥沙利铂处理时,GSDMD显著抑制PARP-1对其底物PAR化的功能,且IF显示GSDMD显著抑制γ-H2AX Foci形成。截断体co-IP示GSDMD与PARP-1的CA Domain相互作用,PARP抑制剂Olaparib抑制GSDMD与PARP-1的结合,FCM检测示Olaparib极大增敏GSDMD敲低时由奥沙利铂诱导的凋亡。IF示多种DNA Damage相关试剂均可引起GSDMD入核,且ATM激酶抑制剂Ku-55933抑制GSDMD入核。核质分离结果示Ku-55933抑制GSDMD的入核,使其滞留于细胞质。FCM检测示Ku-55933能够抑制GSDMD过表达由奥沙利铂引起的凋亡。结直肠癌组织芯片p-ATM IHC示GSDMD核定位与磷酸化ATM表达具有正向相关性。IF示MC38-m Gsdmd稳转细胞株在缺氧与奥沙利铂处理下具有与人源GSDMD相同的核易位现象,并且该细胞株的C57BL/6小鼠皮下成瘤结果示m Gsdmd过表达在奥沙利铂处理下成瘤体积明显减小,瘤块IHC结果示,m Gsdmd过表达未加奥沙利铂组,瘤块内部缺氧区出现m GSDMD入核,Ki67阳性率降低和γ-H2AX阳性率上升,m Gsdmd过表达奥沙利铂处理组,瘤块外环出现m GSDMD入核,Ki67阳性率降低和γ-H2AX阳性率上升。奥沙利铂处理组瘤块γ-H2AX阳性细胞形成DNA Damage Ring,且m Gsdmd过表达组DNA损伤环的宽度较载体对照组大。结论:1.GSDMD在结直肠癌中较对应癌旁组织低表达,且GSDMD核阴性表达提示不良预后。2.GSDMD以非焦亡切割激活的形式,通过调控该蛋白的亚细胞定位,即核易位,封闭PARP-1相关的DNA损伤修复功能,促进凋亡,进而增强DNA损伤相关的化疗药物的化疗敏感性。3.GSDMD的核易位是ATM激酶磷酸化激活依赖性的,从而形成“DNA损伤—ATM磷酸化激活—GSDMD核易位—PARP-1功能封闭—DNA损伤及凋亡”信号正反馈环路。
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