目的肝纤维化是一个细胞外基质沉积和降解失衡的病理过程;活化的肝星状细胞(HSC)能分泌各种细胞因子如转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)等,通过旁分泌和自分泌的形式进一步激活HSC,活化的HSC具有了收缩、增殖和分泌大量的细胞外基质(ECM)包括胶原,层粘连蛋白、蛋白聚糖等的功能;与此同时,分泌的能降解ECM的基质金属蛋白酶(MMPs)减少,而其抑制剂(TIMPs)增多,因此,HSC成为肝纤维化的中心环节。纤维化是可以逆转的。那么如何逆转肝纤维化成为我们迫切要解决的问题。越来越多的研究表明:通过凋亡形式清除活化的HSC是逆转肝纤维化的关键。诱导凋亡的途径很多:如基质金属蛋白酶9 (MMP-9),I型胶原的降解均可诱导HSC凋亡。因此,我们设想:如果MMPs增多,TIMP-1减少,胶原降解,一则可以促进HSC凋亡;二则也可以降解多余的ECM,减轻纤维化程度。所以研究HSC凋亡后ECM是如何代谢的成为该设想的前提条件。方法含10%胎牛血清的DMEM培养HSC-T6,传代后换无血清培养基继续培养。分成对照组和模型组:对照组,N1:即正常HSC-T6,8小时后收获;N2:正常HSC-T6,24小时收获;N3:正常HSC-T6培养8小时后,更换新鲜的DMEM培养基,24小时收获细胞。模型组,M1:加入浓度为100nmol/LH2O2, 8小时收获细胞;M2:加入浓度为100nmol/LH2O2, 24小时收获细胞; M3 :加入浓度为100nmol/LH2O2, 8小时后更换新鲜的DMEM培养基,24小时收获细胞。利用Anexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测HSC凋亡。检测不同凋亡程度时TIMPs、MMPs、及胶原的改变。在实验中,我们选取了3组不同凋亡水平的细胞(5%、58%、71%,编号为A、B、C);利用半定量RT-PCR测定TIMP-1、TIMP-2、MMP-2、MMP-9、COLⅠ、COLⅢ在mRNA水平的表达,利用western检测细胞内TIMP-1蛋白量的表达,利用明胶酶谱分析MMP-2、MMP-9在细胞内和细胞外的蛋白水平表达。结果三个对照组收获细胞的凋亡率分别是5.56%、13.75%、12.58%;三个模型组的凋亡率分别是35.78%、;71.98%、57.55%。对不同凋亡程度时,TIMPs、MMPs、及胶原改变的研究表明:TIMP-1的含量B>A>C;TIMP-2 A≈B>C;MMP-2 B≈C>A;MMP9 B≈C>A;COLⅠA>B>C;COLⅢA>B>C;且COLⅠ的变化梯度> COLⅢ;讨论在HSC-T6自然凋亡过程中,N1与N2组,N1与N3组凋亡率的差别均有统计学意义;但N2与N3凋亡率的差别无统计学意义;因此我们推断:HSC-T6在培养过程中,凋亡率随着时间增加而增加,而更换新鲜培养基(减少ECM、TIMPs、MMPs对HSC的影响)对凋亡无影响。加入H2O2诱导HSC-T6凋亡后,M1、M2、M3三组凋亡率的差别两两比较均有统计学意义。即更换新鲜培养基(减少ECM、TIMPs、MMPs对HSC的影响)能抑制H2O2诱导的HSC凋亡。对于此现象,我们有三个可能推断:第一:MMPs诱导HSC凋亡的能力大于TIMPs抑制凋亡的能力;第二:MMPs的绝对数量大于TIMPs;第三:其他因素的影响如COLⅠ降解促进凋亡等。由此,我们得出结论:ECM、TIMPs、MMPs的改变对H2O2诱导的HSC凋亡有影响。对不同凋亡水平时ECM的代谢变化研究表明:凋亡早期:TIMP-1上升明显,COLⅠCOLⅢ高表达,MMP-2、MMP-9相对较少,而且随着HSC凋亡数量增加又反过来刺激TIMP-1的升高;进而抑制MMP-2、MMP-9的分泌以及胶原的降解,此时HSC抗凋亡能力较强。凋亡晚期:TIMP-1、COLⅠ、COLⅢ的表达也急剧减少,而MMP-2、MMP-9表达增高,因此在凋亡后期促凋亡能力大大增加。TIMP-2整个过程中的表达较低,改变不明显。综上所述,我们看出胶原、MMPs、TIMP-1在整个凋亡过程中起着重要的作用。