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杆状病毒是一类含有包膜的环状双链DNA病毒,是昆虫专一性的病原微生物,被认为是一种理想的生物杀虫剂。但是由于其杀虫速率慢,对高龄幼虫活性低、杀虫谱窄等缺点而限制了其大规模使用。增效蛋白(Enhancin)是一种金属蛋白酶,能够增强杆状病毒和苏云金芽胞杆菌对鳞翅目昆虫的感染。
本论文利用Bac-to-Bac系统,将来自黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segeturngranulovirus,AgseGV)Enhancin基因的部分片段(enhancin4)、苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydia pomonella granulovirus,CpGV)Cp13基因插入到不含增效蛋白基因的苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)中,构建了一系列的重组杆状病毒。为了将增效蛋白包装到病毒包涵体或包涵体来源病毒(ODV)囊膜上,分别将这两个片段与AcMNPV多角体蛋白(Polyhedrin)的全长(phc)或截短片段(pht)以及AcMNPV ODV-E66 N端的23个氨基酸融合。通过PCR验证,获得构建正确的重组AcMNPVs。利用两种增效蛋白的多克隆抗体(anti-Cp13和anti-En4)对重组病毒的包涵体和ODV进行免疫检测,结果表明多角体蛋白的全长或截短序列和ODV-E66膜定位序列分别成功介导Cp13蛋白包装到病毒的包涵体和ODV囊膜上。最后,对包装正确的重组病毒Ac-ph、Ac-Cp13、Ac-E66-Cp13、Ac-pht-Cp13和Ac-phc-Cp13进行生物活性测定。生测结果表明,与仅含多角体蛋白的对照病毒(Ac-ph)相比,Ac-Cp13、Ac-E66-Cp13的LC50分别降低了3.8-4.4和3.6-4.0倍,而Ac-pht-Cp13和Ac-phc-Cp13的LC50分别增加了2.5-3.3和3.3-5.0倍。
本研究的结果表明,定位于ODV囊膜上的增效蛋白能够增加病毒的杀虫活性,为增效蛋白通过增加病毒粒子囊膜与昆虫中肠上皮细胞膜的融合而促进病毒感染的作用机制提供了证据。