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登革热病毒(Dengue Fever Virus,DENV)属于黄病毒科黄病毒属病毒,由四个血清型即DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4组成。登革热病毒一般通过吸血的节肢动物如蚊、蜱等媒介叮咬敏感脊椎动物宿主而传播。目前登革病毒在世界范围内广泛流行,不同血清型登革热病毒的二次感染会产生抗体依赖的感染增强作用,给人类健康带来巨大威胁,但尚无有效的疫苗或药物用于临床治疗。因此研发有效的抗登革热病毒药物显得十分重要。本论文在已知巴马丁具有抗西尼罗病毒活性的基础上,开展了巴马丁抗登革2型病毒的抑制作用及机理研究。
本研究在建立了体内体外检测登革病毒2型NS2B(H)/NS3(pro)丝氨酸蛋白酶活性的基础上,开展了巴马丁抗NS2B(H)/NS3(pro)的活性分析。结果表明:巴马丁对DENV-2 NS2B(H)/NS3(pro)的IC50为340μM;在细胞水平上检测表明当药物浓度为100μM时,巴马丁对NS2B(H)/NS3(pro)切割底物多肽的抑制作用不明显。本研究中未能实现非结构蛋白多肽NS2BNS3NS4A在原核和真核细胞中的成功表达,推测与NS2BNS3NS4A中NS2B、NS4A为跨膜输水蛋白以及多肽中存在多个跨膜螺旋有关。
利用DENV-2全长感染性cDNA克隆、DENV-2瞬时表达复制子以及DENV-2假病毒颗粒等组成的研究平台,检测了巴马丁对其抑制效果。结果表明巴马丁能有效抑制DENV-2活病毒粒子的产生,Ecso＜12.5μM;巴马丁不影响DENV-2病毒的吸附、进入、翻译和复制阶段,推测可能影响病毒粒子的包装或释放或感染性病毒颗粒的形成。此外,进行了11种巴马丁类似物抗登革热病毒活性的检测,发现与巴马丁具有不同母体结构的化合物A、F、G、H、I、J、K抗病毒活性基本丧失,与巴马丁具有相同母体结构但在N2位引入取代基的化合物B、C、D、E随取代基的增大抗病毒活力减弱或丧失。因此推测巴马丁抗病毒活力的发挥与其空间构象有关,N2位的空间位阻效应会影响其抗病毒活力。
此项研究为基于结构的抗病毒药物设计提供了一定的线索,也为进一步阐释巴马丁抗病毒机理提供了依据。