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[研究目的]肿瘤细胞的死亡包括坏死、凋亡、自噬以及其他未知的可能的方式,这些也正是抗癌药物研究的最终目标--消除肿瘤。自噬(Autophagy)是广泛存在于真核细胞内的溶酶体依赖的降解方式,过去十年自噬的研究呈现爆炸性增长的势头。研究发现,自噬和肿瘤发生发展都有密切的联系,在肿瘤中可能扮演双重角色,自噬一方面消除肿瘤细胞,另一方面在应激状态下促进细胞存活,自噬降解产生的生物大分子氨基酸、核苷酸、游离脂肪酸等被细胞重新利用,维持存活生长的需要。羧胺三唑(carboxyamidotriazole, CAI)是人工合成小分子化合物,具有抗肿瘤活性,它的抗肿瘤增殖和转移的机理可能是由于阻断多种形式的钙离子内流,进而影响钙离子下游的信号通路,抑制血管生成。也有报道CAI能够诱导细胞凋亡。同时CAI也具有抗急、慢性炎症作用,抑制多种促炎细胞因子水平。然而在有些细胞上尽管CAI的增殖抑制作用明显,但是诱导凋亡的效应并不显著。因此本文重点研究CAI对于肺腺癌细胞自噬水平的影响,探讨CAI能否导致肿瘤细胞自噬性死亡。为寻找更佳的合用方案提供新的思路。[研究方法]SRB法测定CAI对A549细胞的体外增殖抑制作用,计算其半数抑制浓度(IC50)；AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术测定CAI给药48小时A549细胞凋亡率及CAI合用3-MA的细胞凋亡率；Western blot检测CAI给药后LC3-Ⅱ蛋白水平；EGFP-LC3质粒转染观察细胞自噬泡斑点情况;透射电子显微镜TEM实验观察细胞自噬超微结构和其他细胞器情况；采用溶酶体蛋白酶抑制剂评价CAI对autophagic influx及溶酶体蛋白酶的影响；激光共聚焦显微镜结合MDC荧光染料观察细胞自噬溶酶体水平；流式细胞术结合MDC染色检测CAI对细胞自噬溶酶体的增加百分率；油红O染色观察CAI给药后A549细胞脂滴水平；采用Western-blotting法检测CAI给药条件下细胞内LC3、Beclinl、p-ERK、AMPKα、p-mTOR, SIRT1、p53和caveolin-1蛋白表达的变化。SRB法测定CAI与自噬抑制剂3-MA或自噬激活剂rapamycin合用后对A549细胞的体外抑制作用；AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术CAI/3-MA合用的细胞凋亡率；CalcuSyn软件计算两药合用指数；[研究结果]1.羧胺三唑剂量依赖性地和时间依赖性地抑制A549细胞增殖,72小时IC50=13.81±1.1μM,83小时IC50=5.86±1.06μM。2.CAI促进A549细胞凋亡作用不强,CAI0μM,10μM,20μM,30μM,40μM作用48小时凋亡率分别是7.69%,8.43%,10.09%,11.09%,18.8%。最高浓度CAI40μM比DMSO对照组仅增加11.1%。3.CAI作用24h,增加A549细胞自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ蛋白表达水平,CAI增加A549细胞EGFP+-LC3亮点数目,与DMSO组具有显著差异。4.电镜超微结构结果表明CAI作用24h引起A549细胞自噬泡(AVs)增多。5.Autophagic influx实验表明,预孵育1小时pepstatinA, CAI作用24h,LC3-Ⅱ蛋白水平上升：在E64d/pepstatinA存在下,CAI作用24h,LC3-Ⅱ没有进一步升高,而且LC3-Ⅰ蛋白明显抑制。6.CAI作用24h,增加A549细胞中酸性自噬溶酶体阳性比率,结合于酸性自噬泡上的特异性荧光染料平均荧光强度增加,流式叠加图右移。CAI30μM的平均荧光强度增强31.5%,CAI40μM的平均荧光强度增强76.6%。7.CAI作用24h,增加A549细胞中初级溶酶体数目。自噬溶酶体的增多发生在增殖抑制作用之前,CAI合用rapamycin增强对A549细胞增殖抑制,两者为协同作用。8.CAI作用24h引起A549细胞线粒体损伤。9.CAI作用A549细胞24h,降低mTOR磷酸化水平,降低cyclinE蛋白水平,降低caveolin-1蛋白水平。CAI20μM作用A549细胞随时间延长而升高p53蛋白水平、降低SIRT1蛋白表达。10.CAI和3-MA合用抑制细胞自噬：CAI和3-MA (1.25mM)合用48h,剂量依赖性地下调LC3-Ⅱ蛋白水平,上调p-mTOR蛋白水平,这可能是其自噬水平逐渐下降的原因之一。CAI与5mM3-MA合用24h显著降低LC3-Ⅱ蛋白表达水平。11.3-MA (1.25mM)不增强CAI对A549细胞增殖抑制作用,3-MA (5mM)与CAI合用24h不降低CAI单用下A549细胞存活率。12.合用3-MA(1.25mM)减少了CAI诱导的细胞凋亡。CA30μM,40μM合用5mM的3-MA后凋亡率分别为9.52%,19.58%,和CAI单用无显著差异。说明抑制自噬后凋亡率没有上升。[研究结论]羧胺三唑(CAI)对肺腺癌细胞A549细胞具有明显抑制作用,除了CAI诱导细胞凋亡的因素外,还包括CAI对自噬过程的调控,以及其他的细胞周期阻滞等因素。CAI阻断自噬泡的降解在CAI引起的A549细胞增殖抑制中起到了一定的作用。我们推测CAI可能是CAI通过阻断溶酶体蛋白酶活性的作用,阻断A549细胞自噬泡的降解,导致自噬泡降解产生的氨基酸等生物大分子缺乏,能量补偿不足从而影响细胞增殖。CAI对非mTOR依赖的cAMP-Epac-PLC-ε通路,钙蛋白酶通路的调节也有助于也有可能通过抑制保护性自噬降低A549细胞存活和增殖。CAI和雷帕霉素合用治疗非小细胞肺癌等基础自噬活性高的肿瘤可能具有潜在应用价值。