炭疽芽胞杆菌(简称炭疽杆菌Bacillus anthracis)是被人类证实的第一个细菌病原,革兰氏染色呈阳性,菌体细胞呈竹节状排列,没有鞭毛,炭疽杆菌在温度适宜、氧气充足的外界环境或人工培养基中容易形成芽胞,它对热、干燥、辐射、化学药物等具有极强的抵抗能力,是炭疽杆菌被用来当作生物武器的最主要形式。由炭疽芽胞杆菌感染引起的炭疽(anthrax)病是一种人畜共患的急性烈性传染病,它是世界公认的五大人畜共患病之一,因此,预防和治疗炭疽疾病显得尤为重要。InhA基因与nos基因都是炭疽杆菌的重要毒力基因,前者对调节菌体及宿主内蛋白的分泌有重要作用,后者对清除宿主产生的抑菌物质及抑制宿主内氧化反应起显著作用。本研究首先在已有的炭疽芽胞杆菌减毒株AP422、AP430基础上,构建了inhA基因缺失突变株,以B.anthracis AP422基因组为模板扩增得到上下游同源臂,构建同源重组载体。对炭疽杆菌基因敲除方案进行了优化,利用Cre-LoxP系统筛选到减毒炭疽芽胞杆菌inhA基因缺失突变株,并在DNA水平和蛋白质水平进行了鉴定,最后对突变株的生物学特性进行了分析。PCR鉴定和测序结果显示inhA基因已经完全缺失;经Western blot鉴定无InhA蛋白表达;突变株的生长能力有所减弱,其他分泌蛋白的表达受到影响,并且芽胞形成率明显下降。虽然该突变株无法进入下一步的芽胞疫苗研究,但这一部分内容为今后inhA基因功能的研究和建立高效的基因敲除方法打下了良好的基础。接着,我们以已有的炭疽芽胞杆菌减毒株AP430为出发菌株,构建了一氧化氮合成酶基因nos缺失突变疫苗候选株。首先以B.anthracis AP430基因组为模板扩增得到上下游同源臂,构建同源重组载体,利用优化的基因敲除方法,成功筛选到减毒炭疽芽胞杆菌基因双缺失突变株(?mnt A?nos),并在DNA水平进行鉴定,最后对基因双缺失株进行生理特性分析。PCR鉴定和测序结果显示nos基因已经完全缺失。nos基因缺失株对过氧化氢的敏感性增强,生长能力有所减弱,但芽胞形成能力没有受到影响,为炭疽疫苗优良的候选株。最后,对疫苗候选株进行了安全性评价与免疫性评价。小鼠和豚鼠肌肉注射免疫剂量为2 10~7CFU的疫苗株芽胞,用ELISA检测小鼠和豚鼠血清的抗体水平,结果显示,我国炭疽疫苗A16R、基因双敲除候选疫苗与空白对照的小鼠血清抗PA IgG滴度、小鼠血清抗芽胞IgG滴度以及豚鼠血清抗PA IgG滴度分别为0.56、0.57、0.06;0.64、0.65、0.02;0.63、0.61、0.14,结果说明:与空白对照组相比,A16R组与基因双敲除候选疫苗组引起的免疫反应极显著增加;与A16R相比,基因双敲除候选疫苗引起的免疫反应没有显著改变。对小鼠肌肉注射和皮下注射剂量为210~8CFU的疫苗株芽胞,观察小鼠死亡情况,结果显示,一周内,肌肉注射条件下的A16R组小鼠死亡7只;基因双敲除候选疫苗株组小鼠没有死亡情况,皮下注射条件下的A16R组小鼠死亡6只;基因双敲除候选疫苗株组小鼠没有死亡情况,结果说明:与A16R相比,炭疽杆菌的基因双缺失疫苗候选株毒性已大大降低,安全性提高,为研究炭疽疫苗打下了良好的基础。