目的:急性髓系白血病（Acute myelogenous leukemia,AML）和多发性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）常伴随细胞遗传学变异,在常规化疗诱导的不同缓解期后易复发,造血干细胞移植虽有助于改善生存,但移植后复发难治仍是目前面临的主要问题。恶性肿瘤的免疫治疗是目前最具前景的治疗方式,其中嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptor T cell,CAR-T）免疫疗法使得血液肿瘤甚至实体瘤的免疫治疗模式取得了突破性的进展。CAR-T治疗的基础是不依赖于主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex,MHC）分子的特异性靶点识别和T细胞的靶向杀伤能力。由于CAR-T治疗是以特异性抗原识别为基础的治疗,能够不受细胞遗传学影响,因此,靶点的选择尤为重要,一旦产生脱靶毒性,则会带来严重的毒副作用,理想的靶点应为肿瘤特异性抗原即在肿瘤细胞中特异性高表达,而在正常的细胞中不表达。针对性选择肿瘤生长所需且在多种肿瘤类型中表达的靶点能够拓宽CAR-T治疗适应症,并防止抗原丢失、变异导致的免疫逃逸。CD44v6主要表达于AML和MM肿瘤细胞中,与提高肿瘤细胞的侵袭转移能力和促进肿瘤细胞增殖有关,且在正常的造血干细胞中不表达,CD44v6高表达患者总体预后不良。因此拟构建CD44v6 CAR-T,研究其特异性杀伤AML和MM肿瘤细胞的能力,评估CD44v6作为AML和MM新型靶点的潜在可能性。方法:检索靶向CD44v6可变剪接区特异性抗原的单克隆抗体信息,筛选高亲和力抗体,通过质粒合成技术合成scFv序列后整合至二代CAR框后,以GV400为载体包装CD44v6-CAR慢病毒。磁珠分选人外周血T淋巴细胞后通过T细胞激活珠激活,然后转染CD44v6-CAR慢病毒并体外扩增,即可获取生长状态良好的CD44v6CAR-T细胞,流式检测转染效率以验证是否构建成功同时检测CD44v6抗原表达水平。体外培养AML肿瘤细胞系SKM-1、MOLM-13和MM肿瘤细胞系H929、OPM2、CAG,流式检测各肿瘤细胞CD44v6表达情况;利用q RT-PCR检测SKM-1与MOLM-13中FLT3 m RNA表达水平并进行转录组测序。收集AML/MM肿瘤细胞并标记胞内示踪染料CFSE后,将CD44v6 CAR-T和同组未转染CD44v6-CAR慢病毒的阴性对照T细胞（non-transfected T cell,NT）以不同效靶比共培养24 h,收集细胞并采用流式细胞术检测CAR-T细胞毒性作用;将CD44v6 CAR-T细胞与AML和MM肿瘤细胞以1:1共培养24 h后,标记CD107a流式检测杀伤过程中脱颗粒反应;收集上述靶向杀伤过程中的上清液,采用CBA试剂盒检测上清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF和IFN-γ的分泌水平。结果:慢病毒转染后CD44v6 CAR-T能够有效扩增,生长状态良好,转染效率15.5%-21.1%,其表面CD44v6表达水平较未转染的T细胞明显下调。在AML肿瘤细胞系中,SKM-1为CD44v6表达阴性细胞,MOLM-13为CD44v6表达阳性细胞。相比于SKM-1,MOLM-13天然高表达FLT3基因,转录组学测序发现CD44v6表达与FLT3基因的活化有关。在MM肿瘤细胞系中,H929为CD44v6表达阴性细胞,OPM2表达水平为13.5%～19.8%,而CAG为20.4%～37.1%。相较于NT,CD44v6 CAR-T可有效杀伤CD44v6阳性的AML和MM肿瘤细胞系,且肿瘤细胞CD44v6表达水平越高则被杀伤效果越强,提高效靶比可有效增强杀伤效果。此外,在杀伤过程中,CD44v6CAR-T伴随着明显的脱颗粒反应,CD107a表达升高。检测杀伤过程中的细胞因子水平,IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF和IFN-γ水平明显升高。结论:在AML和MM肿瘤细胞系中可检测出CD44v6高表达细胞,同时CD44v6CAR-T可有效杀伤CD44v6表达阳性的AML和MM肿瘤细胞,在AML中,对FLT3突变细胞系也有明显的杀伤作用。因此,CD44v6可作为未来AML与MM CAR-T治疗的潜在靶点。