【摘 要】
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目的:研究多聚谷氨酰胺疾病蛋白Ataxin-3对parkin介导的线粒体自噬的影响。方法:扩增并提取包含目的基因的质粒(Ataxin-3-20Q-EGFP,Ataxin-3-80Q-EGFP,Ataxin-3-130Q-EGFP,Fl
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目的:研究多聚谷氨酰胺疾病蛋白Ataxin-3对parkin介导的线粒体自噬的影响。方法:扩增并提取包含目的基因的质粒(Ataxin-3-20Q-EGFP,Ataxin-3-80Q-EGFP,Ataxin-3-130Q-EGFP,Flag-parkin,Flag-parkin K161N,Flag-parkin T240R,Flag-parkin C418R,Flag-parkin C431F,Flag-parkin P437L)-20℃ 下保存备用;用相应质粒对人胚胎肾上皮细胞(HEK293细胞)进行转染;用Antimycin A和Oligomycin处理细胞制造线粒体损伤模型,运用免疫荧光法检测Ataxin-3与parkin及其突变体在线粒体上的定位和聚集情况以及线粒体清除的情况。结果:实验中我们发现,在转染的HEK293细胞线粒体损伤后,Ataxin-3-20Q-EGFP,Ataxin-3-80Q-EGFP 和 Ataxin-3-130Q-EGFP 表达的包含不同长度谷氨酰胺重复的Ataxin-3在短时间内就可以在细胞中呈点状富集在损伤的线粒体上,并且和parkin共定位。Ataxin-3在长时间线粒体损伤后的线粒体清除中起到重要的作用。另外我们还发现了 parkin不同病理突变体在线粒体自噬过程中的影响,其中RING0区突变体K161N在部分程度上减缓了到线粒体的转运,RING1区突变体T240R可以转运到线粒体上但不能招募Ataxin-3,RING2区突变体C418R,C431F和P437L完全不能定位在线粒体上。结论:去泛素化酶Ataxin-3蛋白可以和parkin共同作用参与线粒体自噬。parkin不同位点的病理突变导致了其调控线粒体自噬功能的损伤。
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