结肠癌是一种免疫原性相对较高的恶性肿瘤,因此,从理论上来说,采用免疫疗法可以获得良好的效果,但是在临床上,其治疗效果并不理想。这可能与结肠癌患者肿瘤组织中T细胞浸润程度、T细胞的杀伤功能有很大的关系。在癌细胞中诱导免疫原性细胞死亡（ICD）,可导致内源性危险信号以及肿瘤抗原的释放,以有效启动抗癌免疫,激活T细胞的抗肿瘤免疫应答。近年来,自噬被认为是肿瘤细胞免疫逃逸的帮凶,抑制自噬可能是增强T细胞免疫疗法的一种有前途的策略。有研究表明,M2型巨噬细胞（TAM2）可以促进肿瘤异常血管生成,这可能会影响T细胞的招募,因此极化肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）可能会影响T细胞的招募。通常单一的癌症免疫治疗疗效有限,因此利用纳米药物递送系统,联合诱导ICD、抑制自噬和极化TAMs三种策略可能产生强大的抗肿瘤T细胞免疫效应。本课题将阿霉素（DOX）和羟基氯喹（HCQ）用二硫键连接,形成DOX和HCQ小分子前药（DSSH）,该小分子前药可通过一步纳米沉淀法自组装成为粒径均一的纳米粒。为达到自噬抑制有效给药剂量,在自组装过程中载入部分游离HCQ。最后,修饰磷脂-聚乙二醇-甘露糖（DSPE-PEG-Man）,获得小分子前药自组装纳米递送系统DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man,以实现CT26和TAM2双靶向和体内长循环。1、DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man的构建及表征通过紫外可见光谱、核磁共振氢谱、红外图谱、粒径与电位以及透射电镜表征DSSH的成功合成、递送系统装载HCQ、其表面修饰DSPE-PEG-Man。通过优化自组装条件,可得粒径大小约为180 nm的纳米粒,电位约为-26 m V。在此基础上,继续考察制剂的稳定性,结果表明修饰磷脂聚乙二醇（DSPE-PEG）的纳米粒,粒径在24 h内无明显变化,而未修饰的纳米粒,粒径24 h内随时间延长而增大。最后,考察了DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man的体外释放,结果显示在含有谷胱甘肽（GSH）的释放介质中,DSSH和DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man均可释放出DOX和HCQ衍生物,而不含GSH的释放介质中,72 h内二者基本未能释放出DOX衍生物,这是由于纳米粒结构中的二硫键的存在,可响应GSH释放药物。2、DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man体外细胞学研究以CT26和TAM2为模型,首先,通过激光共聚焦荧光显微镜（CLSM）和流式细胞仪考察DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man在CT26和TAM2的体外摄取情况,结果显示,该系统可通过CT26和TAM2表面高度表达的甘露糖受体介导,而显著提高摄入量。其次,通过流式细胞仪检测体外DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man逆转TAMs的表型效果。结果显示,DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man作用12 h后,与对照组相比,M1型巨噬细胞（TAM1）比例由2.5%升至29.5%,TAM2比例由55.0%降低至21.9%。表明DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man可显著将TAM2逆转为TAM1。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测药物处理后巨噬细胞的细胞因子IL-10和IL-6分泌状况,进一步验证DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man对TAMs表型的影响。随后,采用CLSM考察CT26细胞钙网蛋白（CRT）的表达、ELISA试剂盒考察高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的释放,结果显示,DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man治疗组CT26细胞的CRT表达明显增多,HMGB1释放也显著升高,与对照组相比均具有显著性差异,表明DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man可成功诱导ICD。最后,我们通过蛋白质印迹法（Western Blot）检测自噬相关蛋白的表达,定量结果显示,制剂组LC3-II/LC3-I的比值与对照组有显著性差异,表明DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man可明显抑制CT26细胞自噬进展。综上所述,DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man具有较强的CT26和TAM2靶向性,且能有效发挥逆转TAMs表型、诱导ICD和抑制自噬的效应。3、DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man的体内靶向性和药效学研究以CT26荷瘤小鼠为模型,考察DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man在体内的肿瘤靶向性、抗肿瘤活性和生物安全性。活体成像结果显示,IR783标记的DSSH/DSPE-PEG-Man具有良好的肿瘤靶向性。药效学结果显示,DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man给药组有较高的抑瘤率（65.7%）,且显著延长荷瘤小鼠的生存时间。苏木素-伊红染色（H＆E）和原位末端转移酶标记技术（TUNEL）结果显示,DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man肿瘤细胞大面积坏死,细胞凋亡明显（70.1%）。此外,各组小鼠在给药期间,体重均无明显变化,给药结束后,主要脏器H＆E切片均未发现明显的病变,血液生化指标水平均在正常值范围内。综上所述,DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man纳米给药系统在CT26荷瘤小鼠模型上可发挥良好的肿瘤靶向性,且具有良好的抗肿瘤活性和生物安全性。4、DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man的体内免疫效应研究利用流式细胞术检测给药结束后CT26荷瘤小鼠肿瘤组织中免疫细胞的浸润情况。贝克曼流式细胞仪检测结果显示,DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man可显著提高细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）、辅助性T细胞（CD4+T cells）在肿瘤微环境（TME）中的招募和浸润,此外,显著提高了TAM1（4.4%到22.1%）、降低了TAM2（40.4%到16.1%）的比例。通过ELISA检测给药结束后小鼠肿瘤组织内相关细胞因子的表达,结果显示,DSSH（HCQ）/DSPE-PEG-Man组与对照组相比免疫刺激性细胞因子IFN-γ（37.8 pg/m L到99.5 pg/m L）、TNF-α（55.4pg/m L到98.7 pg/m L）、IL-6（43.1 pg/m L到97.4 pg/m L）的表达升高,IL-10（188.0 pg/m L到129.5 pg/m L）的分泌下降。表明该双靶向小分子前药自组装纳米递送系统可以激活机体的抗肿瘤免疫应答力。综上所述,该双靶向小分子前药自组装纳米递送系统具有良好的肿瘤靶向性和抗肿瘤活性,可增强免疫效应性细胞的招募和浸润,重塑TME,在肿瘤免疫方面具有潜在的应用价值。