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第一部分Tisp40对肾缺血再灌注诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响目的:观察肾缺血再灌注损伤后肾组织Tisp40蛋白的表达,并探讨Tisp40对肾缺血再灌注诱导的肾功能损害、肾小管结构破坏和肾小管上皮细胞凋亡的影响及分子机制。方法:首先,我们以野生型小鼠为研究对象,建立肾缺血再灌注损伤和假手术模型。通过Western blot检测Tisp40蛋白的表达水平,通过免疫组织化学染色检测Tisp40蛋白的表达部位和表达量。接着,我们以Tisp40基因敲除小鼠和野生型小鼠为研究对象,建立肾缺血再灌注损伤和假手术模型。通过血清肌酐和尿素氮水平评估小鼠肾功能,通过PAS染色检测肾小管损伤程度,通过TUNEL染色和Cleaved Caspase-3蛋白免疫组织化学染色检测细胞凋亡水平,通过Western blot检测CHOP、Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平。结果:Western blot和免疫组织化学染色发现野生型小鼠肾缺血再灌注后肾组织Tisp40蛋白表达增加,而且Tisp40蛋白表达位于肾小管上皮细胞。肾功能检测发现Tisp40基因敲除小鼠较野生型小鼠肾缺血再灌注后血清肌酐和尿素氮水平降低。PAS染色发现Tisp40基因敲除小鼠较野生型小鼠肾缺血再灌注后肾小管损伤减轻。TUNEL染色和Cleaved Caspase-3蛋白免疫组织化学染色发现Tisp40基因敲除小鼠较野生型小鼠肾缺血再灌注后肾小管上皮细胞凋亡数量减少。Western blot检测发现Tisp40基因敲除小鼠较野生型小鼠肾缺血再灌注后CHOP、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达减少,而Bcl-2蛋白表达增加。结论:肾缺血再灌注损伤后肾组织Tisp40蛋白表达增加。Tisp40基因敲除可以减轻肾缺血再灌注诱导的肾功能损害、肾小管结构破坏和肾小管上皮细胞凋亡,并抑制CHOP介导的细胞凋亡途径。第二部分Tisp40对缺氧/复氧诱导的肾小管上皮细胞HK-2凋亡的影响目的:观察肾小管上皮细胞HK-2缺氧/复氧后Tisp40蛋白的表达,并探讨Tisp40对缺氧/复氧诱导的肾小管上皮细胞HK-2凋亡的影响和分子机制。方法:首先,我们用肾小管上皮细胞HK-2建立缺氧/复氧和对照模型。通过Western blot检测Tisp40蛋白的表达水平,通过免疫细胞化学染色检测Tisp40蛋白的表达部位和表达量。接着,我们构建了Tisp40基因过表达和空载体的稳定转染的肾小管上皮细胞株,并建立缺氧/复氧和对照模型。通过流式细胞术和Hoechst染色检测肾小管上皮细胞凋亡水平,通过Western blot检测CHOP、Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平。结果:Western blot检测发现肾小管上皮细胞缺氧/复氧后Tisp40蛋白表达增加,免疫细胞化学染色发现肾小管上皮细胞缺氧/复氧后Tisp40蛋白在细胞质和细胞核表达均明显增加。流式细胞术和Hoechst染色发现Tisp40基因过表达较空载体组肾小管上皮细胞缺氧/复氧后细胞凋亡增加。Western blot检测发现Tisp40基因过表达较空载体组肾小管上皮细胞缺氧/复氧后CHOP、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达降低。结论:肾小管上皮细胞HK-2缺氧/复氧后Tisp40蛋白表达增加。Tisp40基因过表达加剧缺氧/复氧诱导的肾小管上皮细胞凋亡,并促进CHOP介导的细胞凋亡途径。第三部分Tisp40对肾缺血再灌注损伤中肾小管上皮细胞增殖的影响目的:探讨Tisp40对肾缺血再灌注损伤中肾小管上皮细胞增殖的影响。方法:我们以Tisp40基因敲除小鼠和野生型小鼠为研究对象,建立肾缺血再灌注损伤和假手术模型。通过组织免疫荧光染色检测PCNA蛋白的表达部位和表达量,通过免疫组织化学染色检测p-Erk1/2蛋白的表达部位和表达量。结果:组织免疫荧光染色发现野生型小鼠肾缺血再灌注后肾小管上皮细胞核中PCNA蛋白表达增加,而且Tisp40基因敲除小鼠较野生型小鼠肾缺血再灌注后PCNA蛋白表达进一步增加。免疫组织化学染色发现野生型小鼠肾缺血再灌注后肾小管上皮细胞p-Erk1/2蛋白表达增加,而且Tisp40基因敲除小鼠较野生型小鼠肾缺血再灌注后p-Erk1/2蛋白表达进一步增加。结论:Tisp40基因敲除促进肾缺血再灌注损伤中肾小管上皮细胞增殖。第四部分Tisp40对肾缺血再灌注诱导的肾小管-间质炎症反应的影响目的:探讨Tisp40对肾缺血再灌注后肾小管-间质炎细胞浸润、炎性因子产生和NF-κB信号通路的影响。方法:我们以Tisp40基因敲除小鼠和野生型小鼠为研究对象,建立肾缺血再灌注损伤和假手术模型。通过H&E染色观察肾组织炎细胞浸润程度,通过免疫组织化学染色检测中性粒细胞(MPO阳性)、巨噬细胞(CD68阳性)的浸润和TNF-α、MCP-1蛋白的表达水平,通过Western blot检测IκBα/NF-κB信号通路相关蛋白的表达水平。结果:H&E染色发现野生型小鼠肾缺血再灌注后肾组织炎细胞浸润明显增加,而Tisp40基因敲除小鼠较野生型小鼠肾缺血再灌注后炎细胞浸润减少。免疫组织化学染色发现Tisp40基因敲除小鼠较野生型小鼠肾缺血再灌注后MPO、CD68、TNF-α和MCP-1蛋白表达减少。Western blot检测发现Tisp40基因敲除小鼠较野生型小鼠肾缺血再灌注后p-IκBα和p-P65蛋白表达减少。结论:Tisp40基因敲除可以减轻肾缺血再灌注诱导的炎细胞(中性粒细胞、巨噬细胞)浸润、炎性因子(TNF-α、MCP-1)产生和NF-κB信号通路活化。