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松茸作为一种纯天然的珍稀名贵食用菌类,具有多种活性成分。目前研究比较深入的是其抗辐射功效,化妆品美白功效相对研究较少。本文以松茸作为研究对象,用水、60%乙醇、95%乙醇、乙酸乙酯、超临界二氧化碳流体,对松茸活性成分进行提取,同时,采用水提醇沉法制备松茸粗多糖,对得到的六种提取物进行安全性测定、成分初步分析及美白功效评价,初步筛选松茸中发挥美白功效的活性部位及化学成分类型;对具有潜在美白活性的提取部位,通过正交实验设计对活性成分进行提取工艺优化,用三氯乙酸脱蛋白法、分级醇沉、凝胶渗透色谱——十八角度激光散射联用、凝胶层析等技术对其进行分离纯化及分子量的测定。具体内容如下: 1.综合六种不同方式提取松茸美白活性成分的得率、提取物的安全性、提取物的美白功效三个方面结果,确定松茸美白活性成分的类型为多糖类物质,其最佳提取方法为水提醇沉法。 2.通过单因素实验和正交实验确定了松茸多糖提取的优化工艺:料液比1∶40,100℃下,浸提2.5h,提取次数以2次(提取比例为98.0%)为宜,多糖得率为9.99%。 3.比较Sevag法脱蛋白与三氯乙酸法脱蛋白效果,确定选用三氯乙酸法脱蛋白,三氯乙酸合理用量为多糖溶液体积的10%,蛋白去除率为63.12%,多糖回收率为55.88%。 4.对松茸多糖进行分级醇沉,得到TMSP-1-9九个组分。对分离纯化各阶段松茸多糖提取物分别进行了酪氨酸酶抑制功效、清除DPPH自由基功效的测定。功效实验结果表明:松茸多糖具有抑制酪酸酶功效与抗氧化功效,抑制率随着纯度和浓度的提高而提高,组分TMSP-6与TMSP-2为松茸多糖提取物中对酪氨酸酶起抑制作用的主要有效成分,组分TMSP-2为松茸多糖提取物中起清除DPPH作用的主要有效成分。 5.经凝胶渗透色谱——十八角度激光散射联用系统对分级醇沉产物进行多糖分子量的测定,各组分重均分子量依次为:447000Da和29700 Da、227700Da和23850 Da、965700 Da和22240 Da、17040 Da、12120 Da、9090 Da、8023Da、8100 Da、7968 Da,其中TMSP-1-3各有2个亚组分。 6.根据各组分进行酪氨酸酶抑制率、DPPH清除率测定,多糖分子量的测定结果,将TMSP-6~9合并,进行Sephadex G-100凝胶层析;选择TMSP-2,进行Sephacryl S-300 HR凝胶层析。 7.对TMSP-6~9合并组分用Sephadex G-100凝胶分离纯化,判断其该组分中存在两个亚组分TMSP-6Ⅰ、TMSP-6Ⅱ。经Sephadex G-50凝胶层析鉴定TMSP-6Ⅱ为单一的多糖。 8.对TMSP-6Ⅱ进行美白功效测定,结果表明其抑制酪氨酸酶功效优于TMSP-6(IC50值为136.4μg/mL);其基本无清除DPPH功效。 本文对松茸美白活性成分提取、松茸多糖的分离纯化,为松茸多糖更加细致的研究和实际应用奠定了理论基础。