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目的本研究旨在探讨在唑来膦酸对破骨细胞分化中参与钙信号传递的两个关键分子-Calmodulin和Calcineurin基因表达的影响,探讨它们在唑来膦酸诱发的破骨细胞分化抑制中的作用。方法本实验首先建立了RAW264.7小鼠单核巨噬细胞株培养体系,用浓度为100ng/ml的RANKL(Ligand of receptor activator of nuclear factorκB)诱导RAW264.7破骨细胞向分化。将细胞分为A、B两组,两组细胞均用RANKL诱导4天,而B组的细胞在第二天加入1×10-6M唑来膦酸处理48小时,4天后收获细胞。通过以下检测方法,研究唑来膦酸对破骨细胞分化中Calmodulin和Calcineurin基因表达以及破骨细胞生成的影响:1抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和牙本质磨片吸收陷窝检查,观察A组和B组之间的多核破骨细胞的形成和骨吸收功能的差异;2实时荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光细胞化学用来检测A组和B组破骨细胞的分化中Calmodulin和Calcineurin的m RNA水平;3使用磷酸酶活性试剂盒测定唑来膦酸对破骨细胞分化中Calcineurin活性的影响。结果1 RAW264.7细胞经过RANKL诱导4d后,成功的分化为多核破骨细胞。2A、B组细胞均出现TRAP阳性多核破骨细胞,但是在B组破骨细胞的生成受到明显唑来膦酸的抑制。B组的破骨细胞数量为26.7±3.5,与A组(49.0±2.6)相比有显著下降(P<0.01),减少约44.9%。B组细胞在牙本质磨片上形成的骨吸收陷窝的数目和面积分别是6.7±1.2和997.1±14.8μm2,与A组(13.3±1.5和1676.9±24.9μm2)相比有显著地下降,分别降低了49.6%和40.5%。3、唑来膦酸也抑制了Calmodulin和Calcineurin的基因表达。通过Real-time PCR检测表明,B组中Calmodulin和Calcineurin两个基因的m RNA水平与A组相比分别下降约51%和37%(P<0.05)。Western-blot也显示,B组中的Calmodulin和Calcineurin的蛋白水平与A组相比显著降低(P<0.05),分别减少了78.7%和69.5%。4、Calcineurin的活性分析又进一步证实了B组细胞中Calcineurin的活性在唑来膦酸处理后的24h,48h,72h均受到了显著抑制(P<0.05或P<0.01),但是A、B两组细胞的Calcineurin活性在唑来膦酸处理前(0h)并没有显著差异。结论本研究结果表明,唑来膦酸可以显著抑制破骨细胞生成,并下调破骨细胞分化过程中Calmodulin和Calcineurin的m RNA和蛋白水平。鉴于这两个基因均是Ca2+/Calmodulin/NFATc1信号通路中传输钙信号的关键因子,因而该信号通路可能在唑来膦酸诱发的破骨细胞生成抑制中发挥作用。