背景:近年来,随着我国社会经济事业的发展,成人正畸治疗的比例越来越高。而成人正畸治疗的患者中伴有基础性疾病,如糖尿病等的患者越来越多。临床工作中,我们发现,糖尿病患者拔牙矫正后拔牙区域BMSCs的成骨能力以及在正畸力作用下的骨改建能力都远弱于常人。糖尿病患者体内血糖含量持续升高,会造成各种组织器官的慢性损害、功能障碍,当波及到骨组织时,常导致骨质疏松[1,2],这也是导致糖尿病患者正畸治疗效率低下的原因之一。晚期糖基化终末产物(Advanced Glycation End products,AGEs)是指诸如蛋白质等大分子,在没有酶参与下,通过非酶促糖基化反应,自发的与葡萄糖以及其他的还原单糖反应所生成的稳定的共价加成物,糖尿病患者若血糖长期性控制不佳,会导致AGEs在体内过量生成[3]。AGEs在体内有两个来源,一个是蛋白质和过量的糖在体内合成,另一个是将食物中存在的AGEs摄入体内[4]。有研究表明,随着AGEs在骨骼中的过量累积,会影响成骨细胞的正常功能[5],是导致糖尿病性骨质疏松的重要因素之一[6]。细胞自噬(autophagy)是细胞将自身的一些蛋白质和细胞器包裹在特定的膜结构中,送入溶酶体降解,供细胞再次利用的过程[7].众多文献表明,AGEs可以影响细胞自噬。AGEs可与体内的蛋白质发生直接交联作用从而引起BMSCs细胞自噬水平的变化;也可以与其受体RAGE结合,激活BMSCs细胞内一系列信号传导通路,从而引发细胞自噬活性的改变,影响BMSCs成骨分化,导致骨质疏松[8,9]。内质网是真核细胞中蛋白质的合成、折叠、分泌的重要细胞器,具有非常强大的内稳态体系,但仍然有很多因素可导致内质网的内稳态失衡,形成内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。文献表明,人体内AGEs的增多会诱导ERS而导致细胞损伤、炎症和细胞凋亡[10],且ERS的程度可能与AGEs在体内累积的量的多少相关。有学者指出[11],ERS过于强烈,导致内质网内稳态的紊乱会导致细胞自噬和死亡,其机制可能是通过负调节AKT/TSC/m TOR通路,增强细胞自噬,从而导致细胞死亡。而糖尿病患者体内AGEs异常增多,可能诱导ERS,负调节AKT/TSC/m TOR通路,增强了BMSCs细胞自噬。综上,AGEs对BMSCs自噬及成骨分化的作用及其机制尚不明确。本实验拟研究不同浓度AGEs对大鼠BMSCs成骨分化过程中自噬能力的影响,为探索AGEs对糖尿病患者骨代谢异常中自噬的作用提供新思路。目的:本实验旨在通过探讨AGEs对BMSCs自噬能力及成骨分化的影响,探索其可能的机制,为糖尿病患者骨质疏松的治疗提供新思路。方法:第一部分:将不同浓度梯度的AGEs加入各组BMSCs中培养24h,通过CCK-8检测细胞增殖活性;透射电镜及免疫荧光检测自噬小体形成情况,采用Real-time PCR和Western blot技术检测各组自噬相关基因Beclin1、LC3的表达差异情况。后分别在相应组别中加入自噬抑制剂3-MA和自噬促进剂雷帕霉素,成骨诱导1周后通过Real-time PCR和碱性磷酸酶染色检测各组自噬及成骨相关基因的表达情况。第二部分:将不同浓度梯度的AGEs加入BMSCs中培养24h。通过透射电镜和Real-time PCR检测各组细胞ERS程度。后在AGEs100mg/L和AGEs200mg/L组中分别加入ERS抑制剂GSK2606414或PI3K/AKT/m TOR通路抑制剂LY294002,培养24h后,通过Real-time PCR和Western blot检测各组细胞自噬相关因子Beclin1、LC3表达的情况;通过Western blot检测总AKT及磷酸化AKT蛋白表达。结果:第一部分:不同浓度AGEs加入BMSCs培养24h后,在AGEs≤100mg/L时,加入AGEs处理后,CCK-8检测结果显示BMSCs增殖活性有所上升,透射电镜及免疫荧光显示自噬小体数量增多,自噬及成骨相关基因表达增加,而在AGEs≥200 mg/L时,AGEs处理后BMSCs增殖活性下降,透射电镜及免疫荧光显示自噬小体数量减少,自噬及成骨相关基因表达降低。第二部分:不同浓度AGEs加入BMSCs培养24h后,随着加入的AGEs浓度增高,透射电镜显示ERS增加,Real-time PCR结果显示ERS相关基因PERK、el F2α、ATF4表达增加。在AGEs100mg/L(200mg/L)组中加入ERS抑制剂GSK2606414培养24h后,与AGEs 100mg/L(200mg/L)组相比,自噬相关基因Beclin1、LC3表达减少;磷酸化AKT蛋白表达量增加;ERS相关基因PERK、el F2α、ATF4表达减少。同样组别内加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002后,与AGEs100mg/L(200mg/L)组相比,细胞自噬相关基因Beclin1、LC3表达减少;磷酸化AKT蛋白表达量减少,而总AKT蛋白量无明显差异;ERS相关基因PERK、el F2α的m RNA表达无明显差异。结论:AGEs对BMSCs的自噬和成骨分化具有双向作用。一定时间和浓度范围内,低浓度AGEs(≤100mg/L)可促进BMSCs自噬及成骨分化,而高浓度AGEs(≥200 mg/L)可抑制BMSCs自噬及成骨分化。AGEs可引起BMSCs的ERS,并且在一定的浓度范围内,AGEs浓度越高,BMSCs的ERS的强度越大,而ERS亦参与到BMSCs自噬之中。低剂量(≤100mg/L)的AGEs主要是通过增强ERS反应,促进PERK/e IF2α通路活化而增强自噬的,而高剂量(≥200mg/L)的AGEs对BMSCs细胞自噬的抑制作用可能是通过促进PI3K/Akt/m TOR信号途径激活实现的。AGEs对ERS和PI3K/Akt/m TOR信号途径两者的共同作用可能是造成对BMSCs自噬和成骨分化双向作用的原因之一。