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目的:初步探讨E2F1蛋白和Sedlin蛋白在体内体外有无相互作用,进而为迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT)的靶向治疗提供新的思路。 方法:以含人E2F1全长cDNA序列的质粒为模板,用常规PCR扩增E2F1,构建pcDNA3.1-E2F1-FLAG真核表达载体,将酶切鉴定正确的重组质粒测序。将pcDNA3.1-E2F1-FLAG瞬时转染至HEK293T细胞中,同时制备GST-Sedlin融合蛋白,通过GST Pull-down技术检测E2F1蛋白与Sedlin蛋白在体外有无相互作用。将pcDNA3.1-E2F1-FLAG和pCDGFP-Sedlin分别瞬时转染到COS-7细胞中,观察两者在细胞内的定位现象,将pcDNA3.1-E2F1-FLAG与pCDGFP-Sedlin一起瞬时转染到COS-7细胞中,观察两者在细胞内的共定位现象。将pcDNA3.1-E2F1-FLAG和pCDGFP-Sedlin瞬时转染至HEK293T细胞,通过免疫共沉淀技术检测E2F1与Sedlin蛋白在哺乳动物细胞内有无相互作用。 结果:酶切鉴定和测序结果都证明了pcDNA3.1-E2F1-FLAG质粒构建成功。GST Pull-down实验表明,在体外条件下,E2F1蛋白与Sedlin蛋白存在相互作用。在荧光显微镜下观察到,E2F1蛋白主要分布在COS-7细胞核内,而Sedlin蛋白除了细胞核,在细胞质内也有分布;共定位实验观察E2F1蛋白与Sedlin蛋白在核内存在部分共定位。免疫共沉淀实验表明,在HEK293T细胞中,E2F1蛋白与Sedlin蛋白存在相互作用。 结论:在体外条件下,E2F1蛋白与Sedlin蛋白存在相互作用。在COS-7细胞中,E2F1蛋白与Sedlin蛋白在细胞核存在共定位;在HEK293T细胞中,E2F1蛋白与Sedlin蛋白存在相互作用。