论文部分内容阅读
帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种由基底神经节运动功能环路异常导致的神经退行性疾病。Orexin由orexin A（3561Da）和orexin B（2899Da）构成,通过作用于orexin 1受体（orexin type 1 receptor,OX1R）与orexin 2受体（orexin type2 receptor,OX2R）发挥效应。Orexin在运动控制方面发挥重要作用,多数中枢运动控制区域均接受orexin能神经纤维支配。研究表明orexin系统与PD密切相关,PD患者orexin能神经元数量减少,并且脑脊液中orexin水平降低。此外还有研究指出orexin A对PD细胞模型和动物模型均发挥保护作用,orexin A可缓解PD模型小鼠黑质多巴胺（dopamine,DA）能神经元的退行性变,改善PD模型小鼠运动障碍。有研究发现orexin B可以保护正常大鼠来源的中脑DA能神经元免受神经变性,并可增加酪氨酸羟化酶免疫反应阳性（tyrosine hydroxylase immunoreactivity,TH-ir）神经元的数量,这提示orexin B可能对DA能神经元发挥类似的保护作用。然而目前关于orexin B对黑质神经元的直接电生理效应,及其对PD模型动物运动障碍的调控尚未见报道。目的:观察orexin B对MPTP（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine）PD模型小鼠运动障碍的影响,探讨orexin B对PD模型小鼠黑质神经元的直接电生理作用,并进一步揭示orexin B电生理学及行为学效应的受体机制。方法:本实验采用旷场实验和爬杆实验观察orexin B对PD模型小鼠运动行为的影响;采用在体单细胞外电生理记录观察orexin B对黑质神经元自发放电的影响;采用免疫组织化学染色方法观察黑质神经元TH表达。结果:1.侧脑室注射orexin B改善MPTP PD模型小鼠运动障碍1.1 Orexin B增加MPTP PD模型小鼠自发活动。小鼠在造模成功后的第一天与第七天分别进行旷场实验。第一天的结果显示,各组小鼠的运动总距离存在显著差异（P<0.001）。与对照组相比,NS+MPTP组小鼠运动总距离显著减少（P<0.001）。然而,侧脑室给予orexin B显著增加MPTP PD模型小鼠的运动总距离（与NS+MPTP组相比P<0.001）。联合给予选择性OX2R阻断剂TCS OX2 29可显著减弱orexin B诱导的运动总距离增加（与orexin B+MPTP相比P<0.001）。单独使用TCS OX2 29对MPTP PD模型小鼠运动总距离无明显影响（与NS+MPTP组相比P>0.05）。第七天的结果显示,各组小鼠的运动总距离也存在差异（P<0.01）。各组小鼠与第一天有相似的变化趋势但无统计学差异。1.2 Orexin B改善MPTP PD模型小鼠运动协调障碍。小鼠在造模成功后的第二天与第八天分别进行爬杆实验。结果显示,两次实验各组小鼠T-turn时间（第二天:P<0.001;第八天:P<0.001）和T-LA时间（第二天:P<0.001;第八天:P<0.001）均存在差异。与正常小鼠相比,MPTP PD模型小鼠T-turn时间（第二天:P<0.001;第八天:P<0.001）和T-LA时间（第二天:P<0.001;第八天:P<0.001）延长。然而,侧脑室注射orexin B可缩短MPTP PD模型小鼠的T-turn时间（第二天:与NS+MPTP组相比P<0.001;第八天:与NS+MPTP组相比P<0.001）与T-LA时间（第二天:与NS+MPTP组相比P<0.01;第八天:与NS+MPTP组相比P<0.001）。联合给予TCS OX2 29可减弱orexin B对T-turn时间（第二天:与orexin B+MPTP组相比P<0.01;第八天:与orexin B+MPTP组相比P<0.001）和T-LA时间（第二天:与orexin B+MPTP组相比P<0.05;第八天:与orexin B+MPTP组相比P<0.05）的改善作用。单独注射TCS OX2 29对MPTP PD模型小鼠T-turn时间（与NS+MPTP组相比P>0.05;第八天:与NS+MPTP组相比P>0.05）与T-LA时间（与NS+MPTP组相比P>0.05;第八天:与NS+MPTP组相比P>0.05）无明显影响。1.3 Orexin B缓解MPTP PD模型小鼠黑质DA能神经元退行性变。腹腔注射MPTP诱导的PD模型小鼠黑质TH-ir神经元数量显著减少（n=3,P<0.01）,约为正常小鼠的55.25±2.39%。侧脑室注射orexin B显著减少MPTP PD模型小鼠黑质DA能神经元的丢失,与NS+MPTP组相比,orexin B+MPTP组小鼠TH-ir神经元数量增加到83.50±2.83%（n=3,P<0.05）。2.Orexin B对MPTP PD模型小鼠黑质神经元放电活动的调控2.1 MPTP PD模型小鼠与正常小鼠黑质神经元放电活动的比较。黑质DA能神经元和γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）能神经元均有三种放电模式（规则放电、不规则放电及簇状放电）。与正常小鼠相比,MPTP PD模型小鼠黑质DA能神经元放电频率增高（正常:2.21±0.11 Hz,n=32;MPTP:2.71±0.09 Hz,n=53,t=3.44,P<0.01）,神经元放电模式没有发生显著改变（正常小鼠变异系数（coefficient of variation,CV）值:0.48±0.05,n=32;MPTP小鼠CV值:0.50±0.05,n=53,t=-0.35,P>0.05）。MPTP PD模型小鼠黑质GABA能神经元放电频率高于正常小鼠（正常:8.39±0.29 Hz,n=36;MPTP:10.16±0.32 Hz,n=48,t=81.60,P<0.001）。PD模型小鼠GABA能神经元CV高于正常小鼠（正常:0.31±0.06,n=36;MPTP:0.51±0.07,n=48,t=-2.18,P<0.05）。2.2 Orexin B通过OX2R增加MPTP PD模型小鼠黑质DA能神经元放电频率。在MPTP PD模型小鼠记录到18个DA能神经元,微压力注射100 n M orexin B,观察到9个DA能神经元放电频率由2.59±0.21 Hz增加到3.92±0.40 Hz（t=-6.31,P<0.001）,放电频率平均增加49.46±5.13%。而给予生理盐水的对照组放电频率没有明显改变,放电频率平均增加4.55±2.13%。Orexin B组与生理盐水对照组相比,差异显著（z=-3.18,P<0.001）。注射orexin B后,CV增加（加药前:0.66±0.09,加药后:0.82±0.07,n=9,t=-2.52,P<0.05）。接着,我们比较了orexin B对正常小鼠（基础放电频率:2.26±0.21 Hz,orexin B:3.14±0.32 Hz,n=8,t=-5.34,P<0.01,平均变化:38.04±6.30%）和MPTP PD模型小鼠（49.46±5.13%）DA能神经元的兴奋效应,发现两者差异不显著（z=1.35,P>0.05）。我们探讨了orexin B对MPTP PD模型小鼠黑质DA能神经元兴奋效应的受体机制。记录到12个黑质DA能神经元联合给予10μM TCS OX2 29和orexin B没有显著改变放电率（基础放电频率:2.79±0.16Hz,TCS+orexin B:2.84±0.22 Hz,n=12,t=-0.56,P>0.05）。然而,在之前单独给予orexin B组的18个DA能神经元放电频率由2.57±0.16 Hz改变为3.26±0.28 Hz。联合给予TCS OX2 29和orexin B改变的放电频率（0.90±2.65%）与单独给予orexin B的引起的放电频率变化有显著差异（平均变化:26.37±6.23%,n=18,z=-2.582,P<0.05）。在少数长时间稳定记录的神经元中,第二次单独给予orexin B显著提高了神经元的放电频率（基础放电频率:2.97±0.45 Hz,orexin B:4.03±0.43 Hz,n=2）。这些结果表明,orexin B通过OX2R增加MPTP PD模型小鼠黑质DA能神经元的放电频率。2.3内源性orexins参与PD模型小鼠黑质DA能神经元自发放电活动的调节。在MPTP PD模型小鼠,微压力注射选择性OX2R阻断剂TCS OX2 29使12个黑质DA能神经元中的7个神经元放电频率从2.79±0.22 Hz降低到1.86±0.29 Hz（t=4.25,P<0.01）,平均变化:-34.52±7.43%。TCS OX2 29组与生理盐水对照组相比,差异显著（z=-2.842,P<0.01）。TCS OX2 29没有明显改变DA能神经元的CV值（基础CV值:0.46±0.14;TCS OX2 29:0.56±0.14;n=7,t=-1.73,P>0.05）。TCS OX229对MPTP PD模型小鼠（-34.52±7.43%）黑质DA能神经元的抑制作用与正常小鼠（基础放电频率:2.28±0.33 Hz,TCS OX2 29:1.61±0.21 Hz,n=5,t=4.84,P<0.01,平均变化:-28.75±3.32%）相比无显著差异（z=-0.57,P>0.05）。2.4 Orexin B不影响黑质GABA能神经元自发放电活动。微压力注射orexin B后,不改变MPTP PD模型小鼠和正常小鼠GABA能神经元的放电频率（MPTP PD模型:由10.69±0.55 Hz改变为11.05±0.75 Hz,n=14,t=-1.44,P>0.05,平均变化:2.65±1.94%;正常:由7.73±0.62 Hz改变为7.89±0.72 Hz,n=8,t=-0.98,P>0.05,平均变化:1.70±1.63%）。接着,我们又尝试注射10 n M orexin B与10μM orexin B,结果显示高浓度和低浓度的orexin B均对MPTP PD模型和正常小鼠GABA能神经元的放电频率无明显改变。2.5内源性orexins参与小部分黑质GABA能神经元自发放电活动的调控。在MPTP PD模型小鼠中,微量注射10μM TCS OX2 29没有改变多数黑质GABA能神经元放电频率（基础放电频率:9.76±0.87 Hz;TCS OX2 29:9.66±0.85 Hz;n=8,t=0.93,P>0.05;平均改变:-0.94±1.10%）,只有4个黑质GABA能神经元的放电频率降低（基础放电频率:8.28±0.18 Hz;TCS OX2 29:6.13±0.39 Hz;n=4,t=4.36,P<0.05;平均变化:-25.27±5.51%）。在正常小鼠记录到8个黑质GABA能神经元,给予TCS OX2 29后其中6个神经元的放电频率没有显著改变,只有2个GABA能神经元的放电频率降低（基础放电频率:12.16±2.52 Hz;TCS OX2 29:10.21±2.67Hz;t=13,P<0.05;平均变化:-17.02±4.76%）。结论:我们首次观察到侧脑室给予orexin B可改善MPTP PD模型小鼠的运动障碍,缓解黑质DA能神经元的丢失。Orexin B通过OX2R增加MPTP PD模型小鼠黑质DA能神经元的放电频率。Orexin B不改变黑质GABA能神经元的放电频率。内源性orexins参与调节MPTP PD模型小鼠DA能神经元和GABA能神经元的自发放电活动。本研究为进一步探讨黑质orexin B在PD发病中的作用提供了一定的理论和实验依据。