【摘 要】
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钙依赖性蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinases,CDPKs or CPKs）及其相关蛋白激酶（CDPK-related kinases,CRKs）在植物生长发育及多种胁迫响应中发挥重要作用,但是关于植物CRK及其互作蛋白功能的研究还很少。本文研究了OsCRK6在水稻生长发育中的功能和AtCRK5的互作蛋白AtTRP在拟南芥花粉发育中的功能。主要研究结果如下:1
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钙依赖性蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinases,CDPKs or CPKs）及其相关蛋白激酶（CDPK-related kinases,CRKs）在植物生长发育及多种胁迫响应中发挥重要作用,但是关于植物CRK及其互作蛋白功能的研究还很少。本文研究了OsCRK6在水稻生长发育中的功能和AtCRK5的互作蛋白AtTRP在拟南芥花粉发育中的功能。主要研究结果如下:1.OsCRK6参与水稻株高和抽穗的分子调节研究:（1）进化分析结果表明OsCRK6属于CDPK家族中的SubgroupⅣ。蛋白结构软件分析结果显示OsCRK6具有高度保守的核心激酶区、N端豆蔻酰化位点、4个EF手型结构以及可能的钙调素结合位点。（2）OsCRK6-RNAi转基因植株具有矮化、节间变短、包穗、种子变小等表型。其中矮化主要是由于除倒四节间外的其他节间不同程度变短所致;而包穗则由倒一节间伸长不足导致;种子变小与其长度变短相关,种子宽度无明显变化,千粒重显著下降。OsCRK6-OE转基因植株株高与野生型相比无明显差异,种子长度增加,宽度下降,千粒重无明显变化。（3）蛋白亚细胞定位实验结果表明OsCRK6蛋白定位于细胞膜和细胞质。（4）体外激酶实验结果表明大肠杆菌表达纯化后的OsCRK6-6His融合蛋白具有激酶活性,且活性受Ca2+和Ca M的激活。（5）Bi FC研究结果显示OsCRK6与OsCa M1-3和OsCa M2相互作用,且相互作用主要发生在细胞膜上。（6）定量PCR结果表明外源GA3诱导OsCRK6表达。在OsCRK6-RNAi转基因植株抽穗早期施加GA3可以促进倒一节间伸长,消除包穗表型。同时RNAi植株倒一节间中GA20ox1和GA20ox2基因表达下降,EUI基因表达增加,暗示RNAi植株节间变短可能由活性GA亏缺导致。2.拟南芥CRK5互作蛋白AtTRP功能的进一步研究:（1）获得AtTRP-GFP融合表达的转基因植株,观察了AtTRP在花粉和花粉管中的表达情况。结果显示AtTRP在花粉发育后期及花粉管伸长过程中均有表达,并且呈现点状分布。（2）获得AtTRP-RNAi转基因植株并观察了该植株花粉发育的情况。亚历山大染色结果表明AtTRP-RNAi植株花粉活力与野生型没有差异。中性红染色结果表明RNAi植株的花粉囊泡发育可能受到影响。体外花粉萌发实验结果表明RNAi植株的花粉萌发率显著低于野生型花粉萌发率。（3）运用定点突变技术将AtTRP潜在磷酸化位点突变为丙氨酸,并获得了AtTRPY141A、AtTRPY190A、AtTRPS260A、AtTRPT390A蛋白。体外磷酸化实验结果表明:突变的AtTRP蛋白仍然可以被AtCRK5磷酸化,说明这四个位点可能不是AtTRP的磷酸化位点。
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