论文部分内容阅读
整合素连接激酶(integrin-linked kinase, ILK)是一种胞内的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,参与整合素介导的细胞与细胞外基质的相互作用,调节多种蛋白激酶的磷酸化及多种信号通路。国内外对ILK的研究领域主要在肿瘤形成、组织纤维化以及血管形成等方面,而在瘢痕形成中的作用机制尚不明确。本研究主要通过体外实验,了解整合素连接激酶对瘢痕成纤维细胞增殖分化的影响及机理。第一部分ILK对瘢痕成纤维细胞增殖分化影响的研究目的观察ILK对人瘢痕成纤维细胞增殖分化的影响,以探讨ILK在瘢痕形成中的作用。方法体外分离培养瘢痕成纤维细胞,设计及合成靶向ILK基因的siRNA序列(ILK siRNA),构建ILK表达质粒(ILK cDNA),在jetPRIMETM介导下转染成纤维细胞。实验分为4组：①空白对照组；②jetPRIMETM组；③LK siRNA组；④LK cDNA组。采用XTT比色法检测各组细胞增殖状况,实时荧光定量PCR (RT-PCR)及Western blot法检测ILKmRNA、α-SMA mRNA及其蛋白表达水平。结果XTT比色法检测显示,ILK siRNA组的细胞增殖水平明显低于空白对照组、jetPRIMETM组及ILK cDNA组(P<0.05),而ILK cDNA组的细胞增殖水平明显高于其他分组(P<0.05)；RT-PCR检测ILK siRNA组ILK mRNA和α-SMA mRNA表达均显著低于其他分组(P<0.05),ILK cDNA组ILK mRNA和α-SMA mRNA表达均显著高于其他分组(P<0.05); Western blot检测显示经siRNA转染的成纤维细胞ILK蛋白和α-SMA蛋白表达较弱,而ILK cDNA组的ILK及α-SMA蛋白表达强度显著增加。结论ILK对成纤维细胞增殖具有促进作用,并能够在转录和翻译水平对α-SMA进行上调控制,可能通过促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化,在瘢痕的形成与挛缩中起到重要作用。第二部分ILK影响瘢痕成纤维细胞分化的机理初探——ILK在TGF-β/Smad信号通路中的作用目的观察ILK在TGF-β/Smad信号通路中的作用,以探讨ILK对瘢痕成纤维细胞分化影响的作用机制。方法体外分离培养瘢痕成纤维细胞后,实验分为4组：①对照组；②LK siRNA转染组；③TGF-β1组；④ILKsiRNA+TGF-β1组。采用荧光标记的免疫细胞化学法检测各组成纤维细胞中ILK的表达变化,应用实时荧光定量PCR检测各组成纤维细胞中ILK mRNA、Smad3 mRNA及a-SMA mRNA的表达。结果免疫荧光图像显示：经siRNA沉默后,成纤维细胞的ILK表达下调；经TGF-β1 (5ng/ml)刺激后,ILK表达明显上调。实时荧光定量PCR结果显示：经ILK siRNA转染后,成纤维细胞的ILK mRNA、Smad3 mRNA及a-SMA mRNA表达同时下降；应用TGF-β1刺激后,三者表达重新升高,与对照组及ILK siRNA组相比显著升高(P<0.05)。结论在瘢痕成纤维细胞中,Smad3及a-SMA的mRNA水平可以被ILK上调,而TGF-β1又可以诱导ILK的表达,ILK可能参予Smad蛋白的调控,对TGF-β/Smad信号通路诱导的促成纤维细胞分化作用产生影响。