【研究背景】近年来,关于MSCs(mesenchymal stem cells)的相关研究已经很多,并报道被用于治疗人类多种疾病。前期的研究表明,在动物模型及临床试验中,应用MSCs可以有效缓解风湿性关节炎及促进组织再生。我们实验室前期的研究结果也证明,MSCs可以促进皮肤创面愈合过程中的血管化,并抑制皮肤增生性瘢痕的形成。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMMSCs)是从骨髓中分离提取出来的一种间充质干细胞,已经被大家公认并被广泛应用于临床。颌骨骨髓间充质干细胞(jaw of bone marrow mesenchymal stem cells,JBMMSCs)是来源于口腔中颌骨组织的一种成体干细胞,具有与BMMSCs相类似的克隆形成能力及多向分化潜能。然而微环境的改变(如炎症)严重影响JBMMSCs的生物学性能(如旁分泌功能),是导致其治疗效果下降的重要原因。自噬(autophagy)是胞内囊泡通过包裹错误折叠的蛋白质以及受损的细胞器(如线粒体和内质网)并与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome),将其内容物降解并循环利用的行为,以实现细胞自身的代谢平衡及胞内细胞器的更新。胞外信号调控激酶(extracellular signalregulated kinase,ERK)是一个很重要的调控细胞功能的激酶,并且与ATGs(autophagy-related genes)蛋白相互作用,当敲除ATG5/7时会减少ERK的磷酸化。有研究报道自噬调控BMMSCs的功能从而提高其治疗效果,但是关于自噬在JBMMSCs的旁分泌功能中起着何种作用及其作用机制并不是很明确。因此,在本课题中,我们首先比较了正常及炎症组织来源JBMMSCs的自噬水平及其促ECs血管生成能力的不同,其次,研究了自噬对JBMMSCs旁分泌功能的调控及作用机制,为逆转P-JBMMSCs的旁分泌功能以及对JBMMSCs生物学性能的深入研究提供了新的思路。【研究目的】1.探讨炎症微环境对JBMMSCs的成骨及促ECs血管化功能的影响;2.探讨炎症微环境对JBMMSCs自噬水平的影响;3.探讨自噬通过调控JBMMSCs的旁分泌功能从而影响ECs的血管化功能;4.探讨通过上调P-JBMMSCs的自噬水平逆转其促ECs的血管化功能;5.探讨自噬调控JBMMSCs的旁分泌功能及作用机制。【研究方法】第一部分:正常及炎症组织来源的JBMMSCs生物学性能的比较。首先,我们从临床上收集了颌骨骨髓炎患者的颌骨组织,参照正常颌骨骨髓间充质干细胞(H-JBMMSCs)的分离培养方法,成功分离并培养了炎症组织来源的颌骨骨髓间充质干细胞(P-JBMMSCs)。其次,采用MTT、克隆形成(colony forming unit-fibroblasts,CFU-F)、成骨成脂诱导分化实验对两种干细胞进行了鉴定。最后,我们通过ALP、茜素红染色和western blot检测进一步比较了两种细胞成骨分化能力的差异,以及Matrigel基质胶检测与之共培养后ECs脉管形成能力的差异。第二部分:炎症组织来源的JBMMSCs自噬水平的变化。首先,我们通过western blot和RT-PCR检测了H-JBMMSCs和P-JBMMSCs中自噬相关基因LC3和Beclin-1的表达变化,同时采用细胞免疫荧光技术观察了LC3在细胞中的表达及分布情况,最后通过透射电子显微镜观察细胞中自噬体的超微结构及形成数量。第三部分:自噬调节JBMMSCs促ECs血管化。为了明确自噬在JBMMSCs促ECs血管化功能方面的作用,我们利用Rapamycin上调或转染si-Beclin-1下调JBMMSCs的自噬水平,western blot检测与其共培养后ECs中成血管相关蛋白VEGF、Ang II、PCNA的表达水平,Matrigel基质胶检测ECs脉管形成能力。在此过程中排除了自噬对ECs血管生成能力的直接影响。同时建立皮肤创面模型对体外结果进行验证,观察注射JBMMSCs后第7天和14天创面愈合的大体照片,HE染色观察创面愈合情况,倒置显微镜观察创面愈合处新生毛细血管以及免疫荧光检测创面愈合处血管相关因子CD31的表达。第四部分:Rapamycin逆转P-JBMMSCs促ECs的血管化。为了明确自噬和P-JBMMSCs促ECs血管生成能力下降的相关性,我们利用自噬的激活剂Rapamycin上调P-JBMMSCs的自噬水平后,western blot检测与其共培养后ECs成血管相关蛋白VEGF、Ang II、PCNA的表达水平,Matrigel基质胶检测ECs脉管形成能力。进一步建立皮肤创面模型对其进行验证,观察注射细胞后第7天和14天创面的愈合大体照片,HE染色观察创面愈合情况以及免疫荧光检测创面愈合处血管相关因子CD31的表达。第五部分:自噬通过调控ERK通路促进JBMMSCs旁分泌VEGF。为了明确自噬是通过调控JBMMSCs的旁分泌功能从而影响ECs的血管生成能力。我们首先通过RT-PCR筛选出与自噬关系最为密切的成血管因子,并验证该因子在ECs血管生成中的作用。进一步通过Co-IP实验检测ERK和LC3的结合情况,western blot检测Raf-MEK-ERK通路上相关蛋白的变化,抑制ERK通路后检测VEGF是否发生变化,明确自噬是通过Raf-MEK-ERK通路调控JBMMSCs旁分泌VEGF。【研究结果】第一部分:正常和炎症组织来源的JBMMSCs成骨及促ECs血管生成能力的比较。1.成功地从正常及炎症组织中分离培养出JBMMSCs,并验证其具有增殖能力及多向分化潜能;2.和H-JBMMSCs相比,P-JBMMSCs的成骨分化能力显著下降;3.Matrigel基质胶检测P-JBMMSCs促ECs脉管生成能力也显著低于H-JBMMSCs。第二部分:炎症组织来源的JBMMSCs中自噬水平降低。1.Western blot和RT-PCR结果显示P-JBMMSCs中自噬相关蛋白和基因的表达均下降;2.细胞免疫荧光结果显示P-JBMMSCs中LC3的表达减弱;3.透射电子显微镜观察,结果显示P-JBMMSCs中无明显的自噬体形成。第三部分:自噬正向调节JBMMSCs促ECs血管生成能力。1.Rapamycin不能直接调控ECs的血管化功能;2.皮下注射细胞的方式较静脉注射的方式更能促进皮肤创面的愈合;3.利用Rapamycin或转染si-Beclin-1改变JBMMSCs的自噬水平,其促ECs血管生成能力也随之改变;4.JBMMSCs自噬表达的改变对其凋亡无影响;5.进一步的体内结果表明,自噬可以调控JBMMSCs促进创面皮肤血管化,从而加速创面的愈合。第四部分:Rapamycin逆转P-JBMMSCs促ECs的血管生成能力。1.单纯涂抹Rapamycin对皮肤创面的愈合无明显促进作用;2.Rapamycin逆转P-JBMMSCs促ECs血管新生能力;3.皮下注射Rapamycin激活后的P-JBMMSCs,可以促进皮肤创面的血管新生,进一步加速创面的愈合。第五部分:自噬通过激活ERK通路促进JBMMSCs旁分泌VEGF。1.通过RT-PCR成功地筛选出与自噬相关的促血管生成因子VEGF;2.体内外的实验数据都得出,Rapamycin组VEGF的表达升高;3.VEGF促进皮肤创面的愈合过程中的血管化;4.Rapamycin借助Raf-MEK-ERK通路激活JBMMSCs旁分泌功能,从而促进VEGF的分泌。【研究结论】1.本课题成功地从正常及炎症组织中分离培养了颌骨骨髓间充质干细胞,并对其增殖、克隆形成及成骨成脂分化能力进行了鉴定。通过进一步比较H-JBMMSCs和P-JBMMSCs生物学性能,发现炎症因素导致颌骨骨髓间充质干细胞的成骨及促ECs血管生成能力下降。2.炎症微环境影响颌骨骨髓间充质干细胞的自噬水平下降,这是导致颌骨骨髓间充质干细胞促ECs血管功能下降的重要原因。3.自噬在JBMMSCs促ECs血管化方面发挥着重要的正向调控作用。Rapamycin可以激活JBMMSCs促ECs的血管新生,而通过si-Beclin-1抑制细胞的自噬水平后,其JBMMSCs促ECs血管新生的能力降低。4.上调P-JBMMSCs的自噬水平,可以逆转其对ECs血管化功能的作用。5.自噬借助Raf-MEK-ERK通路激活JBMMSCs的旁分泌功能,促进VEGF的分泌。分泌的VEGF作用于ECs,从而增强其血管新生能力。综合以上结果,我们得出结论炎症微环境影响JBMMSCs促ECs的血管化功能,然而自噬通过激活JBMMSCs的旁分泌VEGF从而正向调节其促ECs的血管化。本研究不仅加深了解了炎症微环境对颌骨骨髓间充质干细胞的生物学性能的影响,而且明确自噬在颌骨骨髓间充质干细胞旁分泌功能中发挥着重要的调控作用,为更好、更清楚的研究颌骨骨髓间充质干细胞功能提供了新的理论和实验依据。