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第一部分睾丸显微取精术治疗非梗阻性无精子症的回顾性研究
【背景与目的】
不孕症是指夫妇一年内未采取任何避孕措施，性生活正常而没有成功妊娠，人群中受不孕症困扰的夫妇约为10-15％,男、女方因素各占50％[1]。其中，男性不育症中最为严重的类型是非梗阻性无精子症（NOA），患者主要表现为睾丸内生精功能低下或生精停滞，其常见的发病原因包括：染色体核型异常、Y染色体微缺失、睾丸炎、隐睾、肿瘤或放化疗等，还有15％的患者是原因不明的[2]。目前，临床上治疗NOA患者最有效的方法是睾丸显微取精术（Micro-TESE），总体精子获取率（SRR）约40%-60%[3-6]。NOA患者可以通过睾丸穿刺、性激素、染色体检查、AZF基因筛查及既往病史等明确诊断，但依然缺乏有效预测Micro-TESE取精结局的术前指征，加上患者的自主选择及临床工作安排变化等，致使大部分NOA患者需要在Micro-TESE手术前预先冷冻卵子或手术获取精子后冷冻精子，只有小部分患者能够使用新鲜精子和新鲜卵子行ICSI治疗。
为了更好的评估卵子玻璃化冷冻和睾丸组织混悬液冷冻微量Micro-TESE精子应用于辅助生殖技术的临床效果，本研究收集了广州医科大学附属第三医院生殖医学中心2015年12月-2017年12月的无精子症患者的病例资料，将Micro-TESE手术中成功获取精子的NOA患者主要分为冷冻卵子和冷冻精子两个研究组别，第一项研究回顾性分析了Micro-TESE新鲜精子与新鲜卵子或冷冻卵子的ICSI注射的受精及妊娠结局，探讨Micro-TESE新鲜精子合并卵子玻璃化冷冻方案的临床效果；第二项研究回顾性分析了Micro-TESE冷冻精子与新鲜卵子的受精及妊娠结局，探讨微量精子睾丸组织混悬液冷冻方法的可行性及其与新鲜卵子ICSI注射的临床应用效果。
【材料与方法】
1.材料
本研究共收集了220名接受Micro-TESE的NOA患者资料，总计103名患者成功获取精子，其中，73名患者使用新鲜精子行ICSI注射入组第一项研究，30名患者使用冷冻精子行ICSI注射入组第二项研究。另外收集了174名梗阻性无精子症（OA）患者和10名取精困难患者的TESA资料。
2.方法
将所有接受Micro-TESE手术的NOA患者按照组织病理学及病因分类，统计不同类型NOA患者成功获取精子的人数，总结不同类型NOA的SRR。第一项研究中，分别将Micro-TESE和TESA取出的新鲜精子与冷冻卵子的ICSI治疗组定义为组1（35名）和组2（10名），分别将Micro-TESE和TESA取出的新鲜精子与新鲜卵子的ICSI治疗组定义为组3（38名）和组4（174名）。分别比较组1和组2之间、组3和组4之间的年龄、性激素水平、睾丸大小等有无差别，并探讨两种手术方法的ICSI治疗结局是否有差异。第二项研究中，将Micro-TESE冷冻精子的NOA患者按照组织病理学分类，分别比较各组别的受精率、优质胚胎率及妊娠率。
【结果】
1.本中心NOA患者Micro-TESE的总的精子获取率为46.8%（103/220），其中，精子生成不足、AZF基因c区缺失的患者精子获取率较高，唯支持细胞综合征及克氏症的患者获取精子的难度较大。
2.NOA患者的FSH水平明显高于取精困难和OA患者；NOA患者的睾酮水平明显低于OA患者；NOA患者的睾丸体积明显小于取精困难和OA患者。
3.玻璃化冷冻卵子的复苏率达到90%，冷冻效果较佳。
4.TESA新鲜精子与Micro-TESE新鲜精子行ICSI注射的受精率无明显差别，但TESA新鲜精子的优质胚胎率及第三天胚胎的可用率要明显高于Micro-TESE新鲜精子。
5.总计30例NOA患者采取了睾丸组织混悬液冷冻方法冻存Micro-TESE微量精子，复苏后的精子总量均接近冻存前的数量，并且Micro-TESE冷冻精子和新鲜精子分别注射新鲜卵子的受精率和临床妊娠率相近，说明睾丸组织混悬液冷冻方法冻存Micro-TESE微量精子的效果较佳。
【结论】
在辅助生殖技术中，不同类型NOA患者Micro-TESE手术的SRR差别较大，明确病因和诊断性穿刺病理结果对术前SRR有一定的预测意义；TESA和Micro-TESE新鲜精子ICSI注射的受精率虽然没有明显差别，但TESA新鲜精子的胚胎早期发育的潜能更好；Micro-TESE新鲜精子联合卵子玻璃化冷冻，Micro-TESE冷冻精子联合新鲜卵子等ICSI治疗NOA患者的临床结局均较满意，为NOA患者的临床治疗提供了更多的策略。
第二部分梗阻性和非梗阻性无精子症患者睾丸组织来源iPSCs系的建立
【背景与目的】
NOA患者中，Micro-TESE手术获取精子的概率约40%-60%[3-6]，依然有将近一半的患者无法获取精子。近年来诸多报道称人诱导多能干细胞系（hiPSCs）可以来源于皮肤成纤维细胞、外周血细胞和角质细胞等[7-9]，并且在体外能分化为各类体细胞系，甚至生殖细胞系。Eguizabal和Easley等报道成功将hiPSCs成功诱导分化成减数分裂后期的单倍体细胞[10，11]，另一份研究称，将hiPSCs诱导分化成生殖细胞后，再与睾丸细胞混合注射到小鼠背部，观察到有新的生精小管生成[12]。诸多hiPSCs体外诱导生殖细胞系的分化研究，为Micro-TESE手术没有获取精子的这部分NOA患者提供了新的希望。
本研究利用梗阻性无精子症（OA）和非梗阻性无精子症（NOA）患者的睾丸组织建立了两株诱导性多能干细胞(iPSCs)系，比较两者建系过程有无差别，并探讨无精子症的发病机制及治疗新方案。
【材料与方法】
1.材料
收集广州医科大学附属第三医院生殖医学中心2017年10月份3例OA患者和3例特发性NOA患者的睾丸组织。该研究获得广州医科大学附属第三医院科学研究伦理委员会批准，所有患者均已签署知情同意书。
2.方法
分别取OA患者和NOA患者5～6mm3的睾丸组织，组织块培养方法进行原代培养，传至3～4代转染仙台病毒，待细胞长满后转移至feeder（饲养层细胞）上继续培养，第21～22天挑取克隆，建立iPSCs系并进行多能性和分化能力的鉴定。
【结果】
两株iPSCs系均成功建立，建系过程无明显差异，AP染色均为阳性；八聚体结合转录因子4（OCT4）、性别决定基因相关蛋白2（SOX2）、阶段特异性胚胎抗原-4（SSEA-4）、肿瘤排斥抗原-1-60（TRA-1-60）的免疫荧光染色均为阳性；小鼠体内的畸胎瘤实验也表明获得的两株iPSCs系具有向三个胚层分化的潜能。
【结论】
利用仙台病毒非基因整合方法，OA患者和NOA患者的睾丸组织均能建立iPSCs系，且两者建系过程无明显差异。
【背景与目的】
不孕症是指夫妇一年内未采取任何避孕措施，性生活正常而没有成功妊娠，人群中受不孕症困扰的夫妇约为10-15％,男、女方因素各占50％[1]。其中，男性不育症中最为严重的类型是非梗阻性无精子症（NOA），患者主要表现为睾丸内生精功能低下或生精停滞，其常见的发病原因包括：染色体核型异常、Y染色体微缺失、睾丸炎、隐睾、肿瘤或放化疗等，还有15％的患者是原因不明的[2]。目前，临床上治疗NOA患者最有效的方法是睾丸显微取精术（Micro-TESE），总体精子获取率（SRR）约40%-60%[3-6]。NOA患者可以通过睾丸穿刺、性激素、染色体检查、AZF基因筛查及既往病史等明确诊断，但依然缺乏有效预测Micro-TESE取精结局的术前指征，加上患者的自主选择及临床工作安排变化等，致使大部分NOA患者需要在Micro-TESE手术前预先冷冻卵子或手术获取精子后冷冻精子，只有小部分患者能够使用新鲜精子和新鲜卵子行ICSI治疗。
为了更好的评估卵子玻璃化冷冻和睾丸组织混悬液冷冻微量Micro-TESE精子应用于辅助生殖技术的临床效果，本研究收集了广州医科大学附属第三医院生殖医学中心2015年12月-2017年12月的无精子症患者的病例资料，将Micro-TESE手术中成功获取精子的NOA患者主要分为冷冻卵子和冷冻精子两个研究组别，第一项研究回顾性分析了Micro-TESE新鲜精子与新鲜卵子或冷冻卵子的ICSI注射的受精及妊娠结局，探讨Micro-TESE新鲜精子合并卵子玻璃化冷冻方案的临床效果；第二项研究回顾性分析了Micro-TESE冷冻精子与新鲜卵子的受精及妊娠结局，探讨微量精子睾丸组织混悬液冷冻方法的可行性及其与新鲜卵子ICSI注射的临床应用效果。
【材料与方法】
1.材料
本研究共收集了220名接受Micro-TESE的NOA患者资料，总计103名患者成功获取精子，其中，73名患者使用新鲜精子行ICSI注射入组第一项研究，30名患者使用冷冻精子行ICSI注射入组第二项研究。另外收集了174名梗阻性无精子症（OA）患者和10名取精困难患者的TESA资料。
2.方法
将所有接受Micro-TESE手术的NOA患者按照组织病理学及病因分类，统计不同类型NOA患者成功获取精子的人数，总结不同类型NOA的SRR。第一项研究中，分别将Micro-TESE和TESA取出的新鲜精子与冷冻卵子的ICSI治疗组定义为组1（35名）和组2（10名），分别将Micro-TESE和TESA取出的新鲜精子与新鲜卵子的ICSI治疗组定义为组3（38名）和组4（174名）。分别比较组1和组2之间、组3和组4之间的年龄、性激素水平、睾丸大小等有无差别，并探讨两种手术方法的ICSI治疗结局是否有差异。第二项研究中，将Micro-TESE冷冻精子的NOA患者按照组织病理学分类，分别比较各组别的受精率、优质胚胎率及妊娠率。
【结果】
1.本中心NOA患者Micro-TESE的总的精子获取率为46.8%（103/220），其中，精子生成不足、AZF基因c区缺失的患者精子获取率较高，唯支持细胞综合征及克氏症的患者获取精子的难度较大。
2.NOA患者的FSH水平明显高于取精困难和OA患者；NOA患者的睾酮水平明显低于OA患者；NOA患者的睾丸体积明显小于取精困难和OA患者。
3.玻璃化冷冻卵子的复苏率达到90%，冷冻效果较佳。
4.TESA新鲜精子与Micro-TESE新鲜精子行ICSI注射的受精率无明显差别，但TESA新鲜精子的优质胚胎率及第三天胚胎的可用率要明显高于Micro-TESE新鲜精子。
5.总计30例NOA患者采取了睾丸组织混悬液冷冻方法冻存Micro-TESE微量精子，复苏后的精子总量均接近冻存前的数量，并且Micro-TESE冷冻精子和新鲜精子分别注射新鲜卵子的受精率和临床妊娠率相近，说明睾丸组织混悬液冷冻方法冻存Micro-TESE微量精子的效果较佳。
【结论】
在辅助生殖技术中，不同类型NOA患者Micro-TESE手术的SRR差别较大，明确病因和诊断性穿刺病理结果对术前SRR有一定的预测意义；TESA和Micro-TESE新鲜精子ICSI注射的受精率虽然没有明显差别，但TESA新鲜精子的胚胎早期发育的潜能更好；Micro-TESE新鲜精子联合卵子玻璃化冷冻，Micro-TESE冷冻精子联合新鲜卵子等ICSI治疗NOA患者的临床结局均较满意，为NOA患者的临床治疗提供了更多的策略。
第二部分梗阻性和非梗阻性无精子症患者睾丸组织来源iPSCs系的建立
【背景与目的】
NOA患者中，Micro-TESE手术获取精子的概率约40%-60%[3-6]，依然有将近一半的患者无法获取精子。近年来诸多报道称人诱导多能干细胞系（hiPSCs）可以来源于皮肤成纤维细胞、外周血细胞和角质细胞等[7-9]，并且在体外能分化为各类体细胞系，甚至生殖细胞系。Eguizabal和Easley等报道成功将hiPSCs成功诱导分化成减数分裂后期的单倍体细胞[10，11]，另一份研究称，将hiPSCs诱导分化成生殖细胞后，再与睾丸细胞混合注射到小鼠背部，观察到有新的生精小管生成[12]。诸多hiPSCs体外诱导生殖细胞系的分化研究，为Micro-TESE手术没有获取精子的这部分NOA患者提供了新的希望。
本研究利用梗阻性无精子症（OA）和非梗阻性无精子症（NOA）患者的睾丸组织建立了两株诱导性多能干细胞(iPSCs)系，比较两者建系过程有无差别，并探讨无精子症的发病机制及治疗新方案。
【材料与方法】
1.材料
收集广州医科大学附属第三医院生殖医学中心2017年10月份3例OA患者和3例特发性NOA患者的睾丸组织。该研究获得广州医科大学附属第三医院科学研究伦理委员会批准，所有患者均已签署知情同意书。
2.方法
分别取OA患者和NOA患者5～6mm3的睾丸组织，组织块培养方法进行原代培养，传至3～4代转染仙台病毒，待细胞长满后转移至feeder（饲养层细胞）上继续培养，第21～22天挑取克隆，建立iPSCs系并进行多能性和分化能力的鉴定。
【结果】
两株iPSCs系均成功建立，建系过程无明显差异，AP染色均为阳性；八聚体结合转录因子4（OCT4）、性别决定基因相关蛋白2（SOX2）、阶段特异性胚胎抗原-4（SSEA-4）、肿瘤排斥抗原-1-60（TRA-1-60）的免疫荧光染色均为阳性；小鼠体内的畸胎瘤实验也表明获得的两株iPSCs系具有向三个胚层分化的潜能。
【结论】
利用仙台病毒非基因整合方法，OA患者和NOA患者的睾丸组织均能建立iPSCs系，且两者建系过程无明显差异。