【摘 要】
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奶牛摄入过量的蛋白质会导致体内血氨浓度增加,影响奶牛子宫的容受性,降低繁殖力。褪黑素（Melatonin,MT）是哺乳动物松果体分泌的吲哚类激素,在抗凋亡、抗氧化、抗炎和保护生殖系统等方面发挥着重要作用。然而,褪黑素能否缓解氨离子导致的子宫内膜上皮细胞的凋亡和容受性的降低,尚不清楚。因此,本研究利用奶牛子宫内膜上皮细胞（Bovine endometrial epithelial cell,BEEC
【基金项目】
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黑龙江省自然科学基金（LH2020C019）；
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奶牛摄入过量的蛋白质会导致体内血氨浓度增加,影响奶牛子宫的容受性,降低繁殖力。褪黑素（Melatonin,MT）是哺乳动物松果体分泌的吲哚类激素,在抗凋亡、抗氧化、抗炎和保护生殖系统等方面发挥着重要作用。然而,褪黑素能否缓解氨离子导致的子宫内膜上皮细胞的凋亡和容受性的降低,尚不清楚。因此,本研究利用奶牛子宫内膜上皮细胞（Bovine endometrial epithelial cell,BEEC）作为体外模型,研究氨离子和褪黑素对子宫内膜上皮细胞凋亡和容受性影响,以及褪黑素是否能缓解氨离子诱导的奶牛子宫内膜细胞损伤和相应的分子机制,为生产中利用褪黑素改善奶牛的繁殖力提供理论参考。氯化氨和褪黑素处理奶牛子宫内膜上皮细胞,利用CCK8、Annexin V-FITC/PI、JC-1、ROS试剂盒检测细胞活力、凋亡、线粒体膜电位、氧化应激水平,实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测凋亡相关基因（p53、Cyt-c、Bax、Bcl-2、Caspase 9、Caspase 8、Caspase 3）、容受性相关基因（VEGF,LIF,EGF）和炎症因子（TLR-4、IL-6、NF-κB）的mRNA和蛋白表达水平,添加NF-κB抑制剂（BAY 11-7082,20μM）和IL-6（1 ng/mL和50 ng/mL）处理子宫内膜上皮细胞,检测VEGF的表达。研究结果表明:（1）5 mM和10 mM的氨离子显著降低了细胞的活力,不同浓度的褪黑素对细胞活力没有影响,共处理时,2.5μM的褪黑素有效缓解了5 mM氨离子导致的细胞活力下降。（2）流式细胞仪检测和Annexin V-FITC/PI染色分析显示,氨离子促进细胞凋亡,共处理时,褪黑素可以缓解氨离子导致的细胞凋亡。（3）ROS试剂盒检测显示,氨离子显著增加了细胞内活性氧的水平,共处理时,褪黑素能降低氨离子诱导的活性氧水平。（4）JC-1染色测定线粒体膜电位显示,氨离子显著降低细胞线粒体膜电位水平,共处理时,褪黑素能提高氨离子诱导的线粒体膜电位水平。（5）qRT-PCR和WB分析显示,氨离子显著增加Bax、p53、Cyt-c、Caspase 9、Caspase8和Caspase 3的mRNA和蛋白表达水平,共处理时,褪黑素显著降低了氨离子诱导的Bax、p53、Caspase 9、Caspase 8和Caspase 3的mRNA和蛋白表达水平。（6）qRT-PCR和WB分析显示,氨离子显著增加TLR-4、NF-κB和IL-6的mRNA和蛋白表达水平,显著降低了VEGF和EGF的mRNA和蛋白表达水平,共处理时,褪黑素显著降低了氨离子诱导的TLR-4、NF-κB和IL-6的mRNA和蛋白表达水平,显著增加了VEGF的mRNA和蛋白表达水平。（7）使用NF-κB抑制剂和IL-6处理细胞,qRT-PCR和WB分析显示,抑制NF-κB信号通路,褪黑素不能缓解氨离子对IL-6和VEGF的mRNA和蛋白表达水平的调控。加入IL-6后,VEGF的mRNA和蛋白表达水平显著降低。综上所述,氨离子通过ROS激活Bax/Cyt-c的线粒体凋亡途径,诱导奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡,通过TLR4/NF-κB/IL-6途径,诱导细胞产生炎症反应;褪黑素通过抑制ROS,缓解子宫内膜上皮细胞凋亡,通过抑制TLR-4/NF-κB信号通路,降低IL-6和提高VEGF的表达。
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