论文部分内容阅读
禽霍乱(Fowl Cholera)是由禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,PM)引起的主要侵害家禽和野禽的一种急性、接触性传染病。PM菌体外膜蛋白(P1pE)是一种交叉保护因子,对异种血清型菌株的感染能提供一定的保护作用。本研究克隆了PMP1pE基因,并以其表达蛋白为抗原制作免疫复合物疫苗,对其免疫效果进行初步研究,结果如下：1.P1pE基因的克隆与原核表达根据禽多杀性巴氏杆菌ATCC12948株脂蛋白E基因(P1pE)序列设计一对特异性引物,经PCR从禽多杀性巴氏杆菌C48-1株中扩增获得了全长P1pE基因,大小为1011 bp,与已报道的基因核苷酸序列同源性为92%-99%,氨基酸序列同源性为90%-99%。将P1pE片段插入原核表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒pET-P1pE并在大肠杆菌中进行了高效表达。SDS-PAGE电泳结果显示,表达的重组蛋白P1pE约为37.8 kDa,与预期大小相符。Western blot检测结果表明重组蛋白P1pE能与C48-1菌体阳性血清发生特异性反应。用纯化的重组蛋白P1pE免疫小鼠,二免后2 W用10 LD50 C48-1菌株攻毒,免疫小鼠获得了100%保护,表明该蛋白具有良好的免疫原性,为禽霍乱亚单位疫苗研制奠定了基础。2.禽霍乱免疫复合物疫苗的初步研究用大肠杆菌表达的禽多杀性巴氏杆菌重组蛋白P1pE作为抗原,与用该蛋白做抗原免疫鸡制得的血清配制成不同比例的免疫复合物,用白羽肉鸡做动物试验。试验鸡随机分成6组,A、B、C组(抗原抗体比例分别为2：1、4：1、8：1)分别注射3种不同比例的复合物疫苗,D组为只注射蛋白的对照组,E组为生理盐水对照组。各组从免疫后第1W起至第5W,每周采血,用ELISA方法检测抗体效价,第5次采血后用禽多杀性巴氏杆菌C48-1株攻毒。试验结果显示以抗原抗体比例为8：1(C组)免疫后所获得的抗体水平和攻毒保护率较高,近期保护率可达90%,A、B、D、E组分别为80%、60%、70%、0。即C组为抗原抗体比例比较合适的一组。