目的：观察正常人晶体与年龄相关性白内障(age-related cataract, ARC)晶体上皮细胞(lens epithelial cell, LECs)中Klotho基因mRNA、蛋白表达情况及甲基水平,分析Klotho基因与ARC之间的关系,探讨该基因的表观遗传变化在ARC发生中的调控机制。材料与方法：1.标本收集：收集2013年9月至2014月10月在河南省人民医院眼科行年龄相关性白内障手术的住院患者60例(患眼60只),均选择第3期成熟期皮质性白内障。术前排除糖尿病、高血压、心脏病等全身疾患,并排除虹膜睫状体炎、青光眼、眼外伤,以及长期眼放射线接触等眼病史,男女不限。实验分组为成青年透明晶体(A组18-30岁,平均年龄,mean±SD,25.00±3.97岁)30例(30眼),男13例,女17例；中年ARC组(B组40-49岁,平均年龄,mean±SD,45.33±3.15岁)30例(30眼)男11例,女19例；老年ARC组(C组67-85岁,平均年龄,mean±SD,75.53±5.76岁)30例(30眼),男12例,女18例。术前由同一医生检查和记录患者性别、年龄、晶状体混浊程度和类型。白内障超声乳化手术由同一医生进行,术中常规连续环形撕囊,直径约5.5mm。正常人晶体(normal transparent group)前囊膜来源于河南省立眼科研究所眼库角膜移植术后透明晶体眼球,显微镜下同样方法留取正常青年人晶状体前囊膜作为对照组。所有晶体前囊膜置于PBS缓冲液中冲洗,排除血液、虹膜色素、晶体皮质、玻璃体等眼内组织的附著。以上取材均通过医院医学伦理委员会批准同意。将获得样品立即置与-80℃冰箱保存。进行基因、蛋白及甲基化检测。2.Klotho基因RT-PCR检测mRNA:将收集的晶体前囊膜迅速加入Trizol的Eppendofff管,PBS冲洗,离心沉淀5×105个细胞,去上清,加入细胞裂解液,离心5min,吸尽液体,干燥RNA, 1min,加入焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate, DEPC)水溶解,-80℃冷冻保存。反转录合成cDNA:测得比值在0.6～1.19之间。普通琼脂糖凝胶电泳进行RNA质量鉴定：(1)制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖,加入1x电泳缓冲液,待水合数分钟后,置微波炉中将琼脂糖融化均匀,加热时应盖上封口膜。(2)胶板的制备：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙,待胶溶液冷却至50℃左右时,轻轻倒入电泳制胶板上,除掉气泡；待凝胶冷却凝固后,垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内,加入1x电泳缓冲液,使电泳缓冲液面刚高出琼脂糖凝胶面。(3)加样：在薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数为2X。用10μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内。4.电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳,最高电压不超过5V/cm。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳。(5)观察和拍照：电泳完毕,取出凝胶。电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分钟,于凝胶成像系统中拍照并保存之。引物设计：利用网络资源GenBank (Klotho ID:16591; Klotho mRNA: NM-013823.1)获得人Klotho基因序列,使用软件Primer Premier5.0设计特异性引物,正义：5’-ACCTGGTGGCGCACAC, 反义:5’-TTGGCAAACCAACC TAGTACA;GAPDH正义：5’-GAAGGTGAAGGTCG GAGT,反义5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC.反转录反应条件：20℃10min,42℃60min使RNA反转录为cDNA,70℃10min灭火反转录酶,置于-20℃冰箱保存备用。RT-PCR的检测：常规PCR产物经适当浓度琼脂糖凝胶电泳成像分析,目的条带清晰,且没有杂带,说明引物设计合成无误,可以进行荧光定量PCR。实时荧光定量PCR的检测：由美国ABI公司合成TaqMan探针,荧光定量PCR仪上进行扩增。Klotho-PCR基因的反应体系：10×PCR缓冲液(Mg2+ free) 3.0μ1; MgCl2 (25mmol/L) 1.8μl; dNTP (25mmol/L) 0.36μl;上游引物(10μmol/L)1.0μ1；下游引物(10μmol/L) 1.0μl; Taq酶(5U/μ1)。进行溶解曲线分析及琼脂糖凝聚电泳验证扩增。每个样本均检测3次,取其平均值,用2-△△Ct法计算Klotho mRNA在不同组别标本中的表达变化。3.免疫组化染色(immunohistochemistry,IHC):将收集的晶体前囊膜标本PBS液冲洗后,细胞面朝上平铺于载玻片上,空气干燥,ABC法染色,室温下1：200山羊抗人Klotho抗体过夜,二抗驴抗羊1：50作用2小时,在DAB反应液中作用5min, PBS液冲洗、终止染色,干燥后封片。结果判定：随机选取5个视野,计数50个细胞,计数阳性细胞数,计算阳性细胞百分率。阳性细胞比例的评分方法为：0分(阳性细胞比例≤5%),1分(5%<阳性细胞比例≤25%),2分(25%<阳性细胞比例≤50%),3分(50%<阳性细胞比例≤75%),4分(75%<阳性细胞比例≤100%)。细胞的染色强度可分为0分(染色阴性),1分(淡黄色颗粒),2分(棕黄色颗粒),3分(褐色颗粒)；按照染色强度与阳性细胞比例综合计分,根据上述2项结果乘积的分数分为4级,分数≤4记为-,4<分数≤8记为+,8<分数<12记为++,分数=12记为+++。其中“-”记为Klotho表达阴性；“+”,“++”,,“+++”记为Klotho表达阳性。4.甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reacti on,MSP)检测Klotho甲基化水平分别提取3组标本的DNA,取500ng DNA进行亚硫酸盐处理,按照EZ DNA Methylation-Gold Kit,取处理后的DNA lul作为模板使用TaqGold DNA聚合酶进行甲基化特异性PCR扩增,反应体系12.5u1,反应条件：95℃变性10min,然后变性95℃30S,退火58℃30s,延伸72℃30S,共40个循环,最后72℃延伸5min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭(EB)染色,在紫外检测仪上观察产物条带。用MethPrimer软件设计甲基化与未甲基引物：分别设计甲基化特异PCR引物(Klotho M primer)和非甲基化特异PCR引物(Klotho U primer)进行PCR反应。用甲基化特异引物进行PCR时,CpG岛C碱基甲基化的DNA能产生特异PCR条带,C碱基未甲基化的DNA则不能产生PCR条带。通过观察klotho基因在人晶体上皮细胞中甲基化和非甲基化特异引物PCR扩增情况来判断是否甲基化阳性。引物信息为Klotho(M)正义：5’-GTCGTCGTTGTAGTTCGTTATC,反义：5’-CAACAAACGCCGATAAT AACG。Klotho(U)正义：5’-TTGTTGTTGTTGTACTTTGTTATT反义5’-CCAAC AAACACCAATAATAAC。 (M):甲基化引物；(U)：非甲基引物。4.统计学处理采用IBM SPSS 19.0统计软件。计量数据采用均值±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),当方差不齐时,采用Welch法进行组间比较；计数资料给出频数及百分比,组间比较采用χ2检验；等级资料给出百分比及平均秩次,组间比较采用Kruskal-Wallis法。结果：1.Klotho基因在晶体上皮的表达水平：Klotho基因在正常青年人晶体组、中年白内障组及老年白内障组相对表达量分别是(mean±SD):1.097±0.140,0.023±0.004,0.004±0.002,差异有统计学意义(P<0.05)。2.Klotho蛋白在晶体上皮细胞的表达水平：正常青年人晶体组Klotho蛋白呈阳性、均匀表达,表达部位位于胞浆及胞膜,中年白内障组表达呈弱阳性,位于晶体前囊膜边缘位置,DAB显色反应不均一,细胞形态变异,有伪足样突起。老年白内障组表达呈阴性。3组比较差异有显著性(P<0.05)。3.Klotho基因甲基化表达水平：透明晶体组、中年白内障组及老年白内障组甲基化发生率分别是3.3%,56.7%,93.3%。白内障组甲基化发生率较透明晶体组明显增高,差异有显著性(P<0.05)。Klotho基因甲基化与基因表达的关系：透明晶体组(A)低甲基化,老年年龄相关性白内障组(C)出现高甲基化,三组比较甲基化阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1.本研究首次发现Klotho基因在正常人晶体上皮细胞有表达,而mRNA及蛋白的表达均随着年龄增加而下降。晶状体上皮细胞(lens epithelial cells, LECs)的衰老、凋亡是年龄相关性白内障(ARC)发生的细胞学基础。正常情况下,人类晶体上皮细胞为柱状细胞其中央区生长相对静止而赤道部分裂旺盛。赤道部晶状体上皮细胞不断分裂、分化,形成晶体纤维细胞并向核心推挤,使得晶状体终生不停生长。这层细胞在终生生长过程中受环境中紫外线、过氧化物以及年龄老化等诱发因素的影响出现凋亡。抗衰老基因是否存在于人晶体上皮细胞,基因的表观遗传性状改变是否影响了晶体上皮细胞的生物学活性、其与ARC的发生是否有关,本实验通过检测直接取材于人的晶体前囊膜中Klotho的表达,从而证实了这一假说。2.Klotho蛋白在正常人晶体上皮表达,表达位置位于细胞浆。Klotho蛋白分为膜型和分泌型两种,其中分泌性蛋白发挥重要功能,参与多个信号转导通路的调控。我们课题组前期的研究发现体外培养的年龄相关性白内障晶体上皮细胞凋亡率较正常晶体上皮细胞增加,而且出现充间质化,本次实验过程中我们观察到了一个有意思的现象：中年白内障组Klotho蛋白的表达位于晶体前囊囊边缘的晶体上皮细胞,中心区无表达,随着年龄增加,晶体上皮细胞形态变化,出现伪足样改变,阳性反应不均一,这与既往的学说即：旁中央区晶体上皮细胞具有生发功能,中心区无生发功能相吻合,同时也提示,该基因及蛋白参与了晶体上皮细胞老化过程。3.Klotho基因在年轻正常透明晶体组低甲基化,基因及蛋白表达阳性；老年白内障患者存在高甲基化,由于基因的表达沉默导致蛋白表达下降甚至不表达。我们推测可能由于Klotho基因表达沉默,导致功能蛋白阴性表达,因此无法发挥对晶体上皮的抗衰的保护作用导致细胞凋亡,进而诱发白内障。由于实验发现Klotho在透明及混浊晶体的甲基化水平发现随着年龄增加Klotho甲基化率升高是该基因及蛋白表达下降的重要原因,后续的研究需要通过体外细胞培养、DNA去甲基化药物干预进一步阐明这种机制。进一步的实验数据比如Western-blotting检测、细胞凋亡率及相关离子水平检测以及其参与的细胞信号通路如P53通路的相关因子的检测,也需进行体外细胞培养来完善,目前我们已经收集了不同来源的人晶体上皮细胞株进行培养,进行数据检测。综上所述,年龄相关性白内障发病机制是个多因素的过程,抗衰老Klotho基因参与了ARC的发生、发展,其表观遗传的改变是老年性白内障发病的原因之一,这一发现从衰老和表观遗传水平阐明了年龄相关性白内障发病机制,值得深入研究。