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一、研究背景白纹伊蚊是登革热的重要传播媒介,在我国大部分地区广泛分布。登革热近年来在我国频繁暴发流行,由于目前没有成熟的疫苗或药物,对其预防控制主要是针对其传播媒介进行控制,特别是对白纹伊蚊成蚊化学杀虫剂的大量广泛应用成为避免疫情加重和扩散的主要措施。溴氰菊酯为经常使用的杀虫剂。然而在长期的溴氰菊酯筛选压力下,已造成白纹伊蚊对其耐受性的提高,且伴随着一系列生理和生化以及基因方面的变化。国外已有报道,媒介按蚊产生抗药性后,对疟原虫的传播能力受到影响;而白纹伊蚊对溴氰菊酯产生抗性后,对登革病毒的感染性和传播性有无改变,目前尚不清楚。本文在实验室建立了白纹伊蚊对溴氰菊酯的抗性品系,并对其对登革病毒的易感性进行了研究。二、研究目的1.应用溴氰菊酯对白纹伊蚊幼虫进行筛选,建立实验室抗性品系。2.对比白纹伊蚊敏感株和抗性株对登革病毒的易感性差异。三、实验方法1.抗性种群筛选应用世界卫生组织(WHO)推荐的蚊虫抗药性测定方法(幼虫浸溃法)检测白纹伊蚊抗性水平,测试种群的半数致死浓度(lethal concentration 50,LC50)。对1500只左右的四龄幼虫按LC50水平施加溴氰菊酯,存活个体继续饲养至羽化,喂血,产卵。按此方法,对每一代都进行溴氰菊酯加压筛选。成蚊抗性水平按WHO成蚊接触筒药膜滤纸接触法进行测试,采用WHO标准的0.05%溴氰菊酯药膜滤纸。2.C6/36细胞富集2型登革病毒,以106.83 TCID50/mL的病毒浓度经口饲感染抗性株和敏感株白纹伊蚊。3.抗原抗体间接免疫荧光实验检测2型登革病毒在中肠、卵巢、唾液腺的存在,初步检测感染效果。4.感染后0/4/7/10天,进行抗性株和敏感株白纹伊蚊中肠、卵巢、唾液腺的解剖、总RNA提取、2型登革病毒特异片段的逆转、聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增、电泳以检测登革病毒是否存在。中肠感染率=阳性中肠样本数/所检测中肠的总样本数,作为病毒感染蚊虫的指标;卵巢感染率=阳性卵巢样本数/所检测卵巢的总样本数,作为病毒在蚊虫体内播散的指标;唾液腺感染率=阳性唾液腺样本数/所检测唾液腺的总样本数,作为蚊虫潜在传播病毒能力的指标。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)测定阳性样本中病毒含量。四.实验结果1.经九代筛选之后,白纹伊蚊幼虫的对溴氰菊酯的抗性水平LC50由0.005mg/L 达到了 0.053mg/L,抗性系数(Resistance Ratio,RR)为 10.60,具有了中度抗性(WHO标准)。十三代幼虫LCso为0.052mg/L,RR为10.40,且九到十三代RR均维持在10-11之间。2.第九代成蚊的生测死亡率为80%。十三代成蚊的生测死亡率为67%。3.荧光显微镜下可观察到抗性株和敏感株感染后4/7/10天中肠、7/10天卵巢和唾液腺的绿色荧光。4.抗性株和敏感株中肠、卵巢、唾液腺感染后0/4/7/10天的RT-PCR检测结果抗性株和敏感株0天时,100%中肠可检测到登革病毒,说明成功使蚊虫摄入登革病毒。感染后4d、7d和10d,白纹伊蚊敏感株和抗性株的中肠阳性率在92.75%～97.18%之间,二者在各时间点均无统计学差异(P>0.05)。感染后4d,可在卵巢检测到DENV-2,敏感株和抗性株的阳性率分别为36.11%和38.89%。感染后7d和10d,两种蚊虫的卵巢阳性率均较4天时有显著上升(P<0.05),感染后7d达到84.7%和77.8%,感染后10d达到84.72%和86.11%,然而各时间点上二者卵巢阳性率之间无明显的统计学差异(P>0.05)。蚊虫唾液腺呈阳性的检测时间点为感染后7d,此时敏感株和抗性株的唾液腺阳性率分别为80.56%和83.33%,无显著的统计学差异(P>0.05)。感染后10d,两感染率均无明显升高。5.RT-qPCR检测显示,在0天时两蚊株中肠和各个时间点卵巢的病毒含量有统计学差异(中肠 0 天,P=0.005;卵巢 4dpi,P=0.012;7dpi,P=0.001;10dpi P=0.006),在随后的时间里病毒量的上升,卵巢中最为显著,抗性株的病毒含量高于敏感株。两蚊株唾液腺的病毒含量均随时间上升,但并无显著统计学差异。五.研究结论1.溴氰菊酯连续应用于白纹伊蚊幼虫会使其幼虫及成蚊对其抗性水平上升,已建立稳定实验室抗溴氰菊酯的中度抗性实验室品系。2.随感染时间的延长,白纹伊蚊不同组织中登革病毒感染率的增长不同。抗性株和敏感株之间并无统计学差异。3.第0天的抗性蚊株中肠有较高的病毒载量,提示其摄血能力较强。抗性株唾液腺较敏感株对2型登革病毒的易感性无显著改变。抗性株卵巢病毒量高于敏感株,说明抗性株卵巢更利于病毒的增殖。