氨基甲酸酯类杀虫剂降解菌的分离、生物学特性及其水解酶基因cehA的克隆和表达

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从生产氨基甲酸酯杀虫剂农药的废水处理系统的污泥中分离筛选到呋喃丹降解菌C3和F3,西维因降解菌X13。根据其形态、生理生化特性及16S rRNA基因序列相似性比较,将C3和F3初步鉴定为Sphingobium sp.,将X13鉴定为Rhizobium sp.。   菌株C3、F3和X13的最适生长温度均为30℃;最适生长pH分别为7.0、6.0、7.0;最适生长NaCl浓度分别为0 g·L-1、5 g·L-1、5 g·L-1;C3、F3和X13对有机氮源的利用明显优于无机氮源,在有机氮源中酵母膏最易被利用。   菌株C3和F3能以呋喃丹为唯一碳源生长,分别在18 h和24 h内完全降解100mg·L-1的呋喃丹;两者降解呋喃丹的最适温度均为30℃,最适pH分别为7.0、6.0,在25-200 mg·L-1的范围内均能较好地降解呋喃丹。加大接种量能够促进C3和F3对呋喃丹的降解。   菌株X13能以西维因为唯一碳源生长,在7 h内将34 mg·L-1的西维因完全降解,X13降解西维因的最适温度为30℃,最适pH为7.0,X13对西维因的降解速率与接种量呈正相关。   根据已报道的氨基甲酸酯水解酶基因cehA设计引物,从C3和X13中能够扩增出该基因,在F3中没有克隆到与氨基甲酸酯水解酶基因相似的序列。通过在线比对序列相似性,在核苷酸水平上它们与西维因降解菌AC100的cehA基因同源性均为99%。将cehA基因构建到表达载体pET32a中,转化到E.coli Rosetta-gami(DE3)中进行了表达,得到了分子量符合预期大小的蛋白质(85KD),但是表达出的蛋白活性比较低,大部分目的蛋白可能以包涵体的形式存在,这还需要以后进一步的研究。   通过PCR的方法在C3和X13中获得了cehA基因上游和下游片段,将其拼接后分别命名为 Tnceh-X13和 Tnceh-C3。两者的序列与AC100的 Tnceh同源性高达99%。对其进行ORF分析,Tnceh-X13和 Tnceh-C3均包含6个ORF,其中包含cehA基因。在cehA基因上游有两个相邻的开放阅读框:istA和istB。将含有istA和istB的这段区域称为ISRsp3,这是IS21家族的IS序列。在cehA的下游有完全相同的ISRsp3,同样来自于IS21家族。在cehA与下游的ISRsp3之间存在一个称之为orfX的ORF。Tnceh序列在C3和X13中序列的高保守性说明了cehA基因在氨基甲酸酯类农药降解过程中存在着水平转移现象。
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