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目的
基于转化生长因子-β1(transforminggrowthfactorbeta,TGF-β1)诱导A549上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的细胞模型，探讨金水缓纤方治疗肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)的机制，为中医药治疗PF提供实验依据。
方法
1A549细胞上皮间质转化模型的建立
不同浓度的TGF-β1(0ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、7.5ng/ml、10ng/ml、12.5ng/ml和15ng/ml)作用于A549细胞，刺激12h，24h，48h和72h。显微镜下观察各组细胞形态，并拍照记录；用CCK-8法测定A549细胞生长情况；用双抗体夹心酶联免疫吸附法(enzyme linked-immunol-sorbent assay, ELISA)测定α-平滑肌肌动蛋白(α-Smoothmuscleactin,α-SMA)的分泌情况。
2金水缓纤方调控Wnt/β-catenin通路抑制A549细胞间质转化
2.1分组与处理
将A549细胞以1×105个/孔种植于6孔板中，培养24h后，开始干预。实验共分为9组：空白对照组(5%空白鼠血清组，简称Control组)、金水缓纤方含药血清组(5%金水缓纤方含药血清组，简称C-JSF组)、吡非尼酮含药血清组(5%吡非尼酮含药血清组，简称C-PND组)、β-cat基因沉默阴性对照组(5%空白鼠血清+siRNA阴性对照组，简称NC-siRNA组)、β-cat基因沉默组(5%空白鼠血清+β-cateninsiRNA组，简称C-siRNA组)、TGF-β1模型组(5%空白鼠血清+7.5ng/mlTGF-β1组，简称Model组)、TGF-β1+β-cat基因沉默组(5%空白鼠血清+7.5ng/mlTGF-β1+β-cateninsiRNA组，简称M-siRNA组)、TGF-β1+金水缓纤方含药血清组(5%金水缓纤方含药血清+7.5ng/mlTGF-β1组，简称M-JSF组)、TGF-β1+吡非尼酮含药血清组(5%吡非尼酮含药血清+7.5ng/mlTGF-β1组，简称M-PND组)。各组分别给予相应的处理后，37℃、5%CO2培养箱孵育48h，弃去培养基上清，收获细胞。每组2复孔，每实验重复3次。2.2ELISA法测定细胞外基质
ELISA法测定细胞外基质(extra cellular matrix, ECM)α-SMA、E-钙粘蛋白(E-cadherin, E-cad)、I型胶原蛋白(Collagen I, ColI)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ,ColⅢ)、纤维连接蛋白(Fibronectin 1, Fn1)、基质金属蛋白酶9(matrix metallo proteinase 9, MMP9)和基质金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1, TIMP-1)的分泌情况。
2.3qPCR和WB检测通路相关指标
采用实时荧光定量聚合酶链反应技术(Real-time Quantitative, PCR Detecting System,qPCR)检测Wnt/β-catenin信号通路相关指标β-连环蛋白(β-catenin,β-cat)、Wnt-1、糖原合成酶激酶-3β(GlycogenSynthaseKinase-3β,GSK-3β)、Dickkopf1(DKK-1)mRNA的表达；采用蛋白质印迹法(western blot, WB)检测β-catenin、β-连环素磷酸化(Phosphorylationβ-catenin,P-β-catenin)、Wnt-1、GSK-3β和DKK-1蛋白的表达。
结果
1A549细胞上皮间质转化模型的建立
细胞形态结果显示7.5ng/ml的TGF-β1刺激48h，A549细胞形态变化较大，细胞明显由原来的铺路石状变为长梭形。
细胞生长情况:与Control组相比，2.5ng/ml和5ng/mlTGF-β1在24h时细胞增殖率显著升高(P＜0.05,P＜0.01)；7.5ng/mlTGF-β1在四个时间点均升高，以48h时更显著(P＜0.05,P＜0.01)，从72h增殖作用开始减弱。与7.5ng/mlTGF-β1相比2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、12.5ng/ml和15ng/ml在四个时间点增殖作用均下降(P＜0.05,P＜0.01)。以7.5ng/mlTGF-β1刺激48h细胞增殖作用显著增强且作用稳定。
α-SMA的分泌情况:与Control组比较，2.5ng/mlTGF-β1在12h、24h和72h时细胞分泌α-SMA的量显著升高(P＜0.05)；5ng/ml和7.5ng/mlTGF-β1在四个时间点均显著升高(P＜0.05,P＜0.01)；10ng/mlTGF-β1在48h时显著升高(P＜0.05)。7.5ng/mlTGF-β1与2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml相比在24h、48h和72h显著升高(P＜0.05)，以48h分泌量升高最明显，从72h分泌量开始下降。
2金水缓纤方调控Wnt/β-catenin通路抑制A549细胞上皮间质转化
2.1金水缓纤方对各组细胞α-SMA和E-cad蛋白的影响
与Control组比较，C-JSF组、C-PND组和C-siRNA组E-cad浓度显著升高(P＜0.01)；Model组α-SMA显著升高，E-cad显著降低(P＜0.01)。与Model组比较，C-siRNA组、M-siRNA组、M-JSF组和M-PND组α-SMA显著降低，E-cad显著升高(P＜0.01)。与M-JSF组比较，C-JSF组α-SMA和E-cad显著降低(P＜0.01)；M-PND组α-SMA显著升高(P＜0.05)。与C-siRNA组比较，NC-siRNA组α-SMA显著升高，E-cad浓度显著降低(P＜0.01)。
2.2金水缓纤方对细胞外基质ColI、ColⅢ和Fn1的影响
与Control组比较，C-JSF组、C-PND组和C-siRNA组ColI和Fn1浓度显著降低(P＜0.05,P＜0.01)；Model组ColI和Fn1显著升高(P＜0.01)，ColⅢ有升高，但无统计学意义(P＞0.05)。与Model组比较，C-siRNA组、M-JSF组和M-PND组ColI、ColⅢ和Fn1显著降低(P<0.05,P＜0.01)；M-siRNA组ColⅢ和Fn1显著降低(P＜0.01)。与M-JSF组比较，C-JSF组ColI显著升高，Fn1显著降低(P＜0.01)；M-siRNA组ColI和ColⅢ显著升高，Fn1显著降低(P＜0.05,P＜0.01)；M-PND组Fn1浓度显著降低(P＜0.01)。与C-siRNA组比较，NC-siRNA组ColI浓度显著升高(P＜0.01)。
2.3各组细胞MMP9、TIMP-1及MMP9/TIMP-1的变化
与Control组比较，C-JSF组MMP9浓度显著降低(P＜0.05)；C-PND组TIMP-1浓度显著降低(P＜0.05)；Model组TIMP-1浓度显著升高，MMP9/TIMP-1比值显著降低(P＜0.05，P<0.01)。与Model组比较，M-siRNA组TIMP-1显著降低(P＜0.01)；M-JSF组MMP9和MMP9/TIMP-1比值显著升高，TIMP-1浓度显著降低(P＜0.05,P＜0.01)。与M-JSF组比较，C-JSF组MMP9浓度和MMP9/TIMP-1比值显著降低(P＜0.05)；M-siRNA组TIMP-1显著降低(P＜0.01)。与C-siRNA组比较，NC-siRNA组MMP9浓度显著降低(P＜0.05)。
2.4各组细胞β-catenin、Wnt-1、GSK-3β和DKK-1基因表达
与Control组比较，C-PND组GSK-3βmRNA表达显著升高(P＜0.05)；C-siRNA组β-catenin表达显著降低，GSK-3β表达显著升高(P＜0.01)；Model组β-catenin和Wnt-1表达显著升高，GSK-3β和DKK-1表达显著降低(P＜0.05,P＜0.01)。与Model组比较，C-siRNA组、M-siRNA组和M-JSF组β-catenin和Wnt-1表达显著降低，GSK-3β和DKK-1表达显著升高(P＜0.05,P＜0.01)；M-PND组Wnt-1mRNA表达显著降低，GSK-3β和DKK-1表达显著升高(P＜0.05,P＜0.01)。与M-JSF组比较，C-JSF组β-catenin、Wnt-1和GSK-3βmRNA表达显著降低(P＜0.05,P＜0.01)；M-PND组GSK-3βmRNA表达显著降低(P＜0.01)。与C-siRNA组比较，NC-siRNA组β-catenin、Wnt-1和DKK-1mRNA表达显著升高，GSK-3βmRNA表达显著降低(P＜0.05,P＜0.01)。
2.5各组细胞β-catenin、P-β-catenin、Wnt-1、GSK-3β和DKK-1蛋白表达
与Control组比较，C-JSF组P-β-catenin蛋白表达显著降低(P＜0.05)；C-siRNA组P-β-catenin显著升高(P＜0.01)；Model组β-catenin显著升高，P-β-catenin显著降低(P＜0.05,P＜0.01)。与Model组比较C-JSF组、C-PND组、M-JSF组和M-PND组P-β-catenin蛋白表达显著升高(P＜0.01)；C-siRNA组和M-siRNA组β-catenin显著降低，P-β-catenin显著升高(P＜0.05,P＜0.01)。与M-JSF组比较C-JSF组β-catenin和P-β-catenin蛋白表达显著降低(P＜0.05,P＜0.01)；M-siRNA组P-β-catenin蛋白表达显著降低(P＜0.05)。与C-siRNA组比较，NC-siRNA组β-catenin蛋白表达显著升高，P-β-catenin蛋白表达显著降低(P＜0.01)。
与Control组比较，C-JSF组Wnt-1蛋白表达显著降低(P＜0.01)；C-PND组Wnt-1和DKK-1显著降低，GSK-3显著升高(P＜0.05,P＜0.01)；C-siRNA组Wnt-1蛋白表达显著降低(P＜0.01)；Model组Wnt-1蛋白表达显著升高，GSK-3β和DKK-1显著降低(P＜0.05,P＜0.01)。与Model组比较，C-siRNA组、M-siRNA组和M-PND组Wnt-1蛋白表达显著降低，GSK-3β和DKK-1显著升高(P＜0.05,P＜0.01)；M-JSF组Wnt-1显著降低，DKK-1显著升高(P＜0.05,P＜0.01)。与M-JSF组比较，C-JSF组和M-siRNA组Wnt-1和DKK-1蛋白表达显著降低(P＜0.01)；M-PND组DKK-1蛋白表达显著降低(P＜0.01)。与C-siRNA组比较，NC-siRNA组Wnt-1和DKK-1表达显著升高(P＜0.01)，GSK-3β蛋白表达显著降低(P＜0.05)。
结论
1成功制备A549细胞上皮间质转化模型，以7.5ng/ml的TGF-β1作用于A549细胞48h，细胞形态明显变为长梭形，细胞增殖显著且增殖作用稳定，细胞分泌α-SMA水平显著升高。
2金水缓纤方可抑制TGF-β1诱导的A549细胞上皮间质转化，减少α-SMA分泌，增加E-cad蛋白表达，减少细胞外基质ColI、ColⅢ和Fn1沉积，增加MMP9蛋白量和MMP9/TIMP-1比值，使细胞外基质分解加剧，减轻EMT进程，其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路活性有关。
基于转化生长因子-β1(transforminggrowthfactorbeta,TGF-β1)诱导A549上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的细胞模型，探讨金水缓纤方治疗肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)的机制，为中医药治疗PF提供实验依据。
方法
1A549细胞上皮间质转化模型的建立
不同浓度的TGF-β1(0ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、7.5ng/ml、10ng/ml、12.5ng/ml和15ng/ml)作用于A549细胞，刺激12h，24h，48h和72h。显微镜下观察各组细胞形态，并拍照记录；用CCK-8法测定A549细胞生长情况；用双抗体夹心酶联免疫吸附法(enzyme linked-immunol-sorbent assay, ELISA)测定α-平滑肌肌动蛋白(α-Smoothmuscleactin,α-SMA)的分泌情况。
2金水缓纤方调控Wnt/β-catenin通路抑制A549细胞间质转化
2.1分组与处理
将A549细胞以1×105个/孔种植于6孔板中，培养24h后，开始干预。实验共分为9组：空白对照组(5%空白鼠血清组，简称Control组)、金水缓纤方含药血清组(5%金水缓纤方含药血清组，简称C-JSF组)、吡非尼酮含药血清组(5%吡非尼酮含药血清组，简称C-PND组)、β-cat基因沉默阴性对照组(5%空白鼠血清+siRNA阴性对照组，简称NC-siRNA组)、β-cat基因沉默组(5%空白鼠血清+β-cateninsiRNA组，简称C-siRNA组)、TGF-β1模型组(5%空白鼠血清+7.5ng/mlTGF-β1组，简称Model组)、TGF-β1+β-cat基因沉默组(5%空白鼠血清+7.5ng/mlTGF-β1+β-cateninsiRNA组，简称M-siRNA组)、TGF-β1+金水缓纤方含药血清组(5%金水缓纤方含药血清+7.5ng/mlTGF-β1组，简称M-JSF组)、TGF-β1+吡非尼酮含药血清组(5%吡非尼酮含药血清+7.5ng/mlTGF-β1组，简称M-PND组)。各组分别给予相应的处理后，37℃、5%CO2培养箱孵育48h，弃去培养基上清，收获细胞。每组2复孔，每实验重复3次。2.2ELISA法测定细胞外基质
ELISA法测定细胞外基质(extra cellular matrix, ECM)α-SMA、E-钙粘蛋白(E-cadherin, E-cad)、I型胶原蛋白(Collagen I, ColI)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ,ColⅢ)、纤维连接蛋白(Fibronectin 1, Fn1)、基质金属蛋白酶9(matrix metallo proteinase 9, MMP9)和基质金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1, TIMP-1)的分泌情况。
2.3qPCR和WB检测通路相关指标
采用实时荧光定量聚合酶链反应技术(Real-time Quantitative, PCR Detecting System,qPCR)检测Wnt/β-catenin信号通路相关指标β-连环蛋白(β-catenin,β-cat)、Wnt-1、糖原合成酶激酶-3β(GlycogenSynthaseKinase-3β,GSK-3β)、Dickkopf1(DKK-1)mRNA的表达；采用蛋白质印迹法(western blot, WB)检测β-catenin、β-连环素磷酸化(Phosphorylationβ-catenin,P-β-catenin)、Wnt-1、GSK-3β和DKK-1蛋白的表达。
结果
1A549细胞上皮间质转化模型的建立
细胞形态结果显示7.5ng/ml的TGF-β1刺激48h，A549细胞形态变化较大，细胞明显由原来的铺路石状变为长梭形。
细胞生长情况:与Control组相比，2.5ng/ml和5ng/mlTGF-β1在24h时细胞增殖率显著升高(P＜0.05,P＜0.01)；7.5ng/mlTGF-β1在四个时间点均升高，以48h时更显著(P＜0.05,P＜0.01)，从72h增殖作用开始减弱。与7.5ng/mlTGF-β1相比2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、12.5ng/ml和15ng/ml在四个时间点增殖作用均下降(P＜0.05,P＜0.01)。以7.5ng/mlTGF-β1刺激48h细胞增殖作用显著增强且作用稳定。
α-SMA的分泌情况:与Control组比较，2.5ng/mlTGF-β1在12h、24h和72h时细胞分泌α-SMA的量显著升高(P＜0.05)；5ng/ml和7.5ng/mlTGF-β1在四个时间点均显著升高(P＜0.05,P＜0.01)；10ng/mlTGF-β1在48h时显著升高(P＜0.05)。7.5ng/mlTGF-β1与2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml相比在24h、48h和72h显著升高(P＜0.05)，以48h分泌量升高最明显，从72h分泌量开始下降。
2金水缓纤方调控Wnt/β-catenin通路抑制A549细胞上皮间质转化
2.1金水缓纤方对各组细胞α-SMA和E-cad蛋白的影响
与Control组比较，C-JSF组、C-PND组和C-siRNA组E-cad浓度显著升高(P＜0.01)；Model组α-SMA显著升高，E-cad显著降低(P＜0.01)。与Model组比较，C-siRNA组、M-siRNA组、M-JSF组和M-PND组α-SMA显著降低，E-cad显著升高(P＜0.01)。与M-JSF组比较，C-JSF组α-SMA和E-cad显著降低(P＜0.01)；M-PND组α-SMA显著升高(P＜0.05)。与C-siRNA组比较，NC-siRNA组α-SMA显著升高，E-cad浓度显著降低(P＜0.01)。
2.2金水缓纤方对细胞外基质ColI、ColⅢ和Fn1的影响
与Control组比较，C-JSF组、C-PND组和C-siRNA组ColI和Fn1浓度显著降低(P＜0.05,P＜0.01)；Model组ColI和Fn1显著升高(P＜0.01)，ColⅢ有升高，但无统计学意义(P＞0.05)。与Model组比较，C-siRNA组、M-JSF组和M-PND组ColI、ColⅢ和Fn1显著降低(P<0.05,P＜0.01)；M-siRNA组ColⅢ和Fn1显著降低(P＜0.01)。与M-JSF组比较，C-JSF组ColI显著升高，Fn1显著降低(P＜0.01)；M-siRNA组ColI和ColⅢ显著升高，Fn1显著降低(P＜0.05,P＜0.01)；M-PND组Fn1浓度显著降低(P＜0.01)。与C-siRNA组比较，NC-siRNA组ColI浓度显著升高(P＜0.01)。
2.3各组细胞MMP9、TIMP-1及MMP9/TIMP-1的变化
与Control组比较，C-JSF组MMP9浓度显著降低(P＜0.05)；C-PND组TIMP-1浓度显著降低(P＜0.05)；Model组TIMP-1浓度显著升高，MMP9/TIMP-1比值显著降低(P＜0.05，P<0.01)。与Model组比较，M-siRNA组TIMP-1显著降低(P＜0.01)；M-JSF组MMP9和MMP9/TIMP-1比值显著升高，TIMP-1浓度显著降低(P＜0.05,P＜0.01)。与M-JSF组比较，C-JSF组MMP9浓度和MMP9/TIMP-1比值显著降低(P＜0.05)；M-siRNA组TIMP-1显著降低(P＜0.01)。与C-siRNA组比较，NC-siRNA组MMP9浓度显著降低(P＜0.05)。
2.4各组细胞β-catenin、Wnt-1、GSK-3β和DKK-1基因表达
与Control组比较，C-PND组GSK-3βmRNA表达显著升高(P＜0.05)；C-siRNA组β-catenin表达显著降低，GSK-3β表达显著升高(P＜0.01)；Model组β-catenin和Wnt-1表达显著升高，GSK-3β和DKK-1表达显著降低(P＜0.05,P＜0.01)。与Model组比较，C-siRNA组、M-siRNA组和M-JSF组β-catenin和Wnt-1表达显著降低，GSK-3β和DKK-1表达显著升高(P＜0.05,P＜0.01)；M-PND组Wnt-1mRNA表达显著降低，GSK-3β和DKK-1表达显著升高(P＜0.05,P＜0.01)。与M-JSF组比较，C-JSF组β-catenin、Wnt-1和GSK-3βmRNA表达显著降低(P＜0.05,P＜0.01)；M-PND组GSK-3βmRNA表达显著降低(P＜0.01)。与C-siRNA组比较，NC-siRNA组β-catenin、Wnt-1和DKK-1mRNA表达显著升高，GSK-3βmRNA表达显著降低(P＜0.05,P＜0.01)。
2.5各组细胞β-catenin、P-β-catenin、Wnt-1、GSK-3β和DKK-1蛋白表达
与Control组比较，C-JSF组P-β-catenin蛋白表达显著降低(P＜0.05)；C-siRNA组P-β-catenin显著升高(P＜0.01)；Model组β-catenin显著升高，P-β-catenin显著降低(P＜0.05,P＜0.01)。与Model组比较C-JSF组、C-PND组、M-JSF组和M-PND组P-β-catenin蛋白表达显著升高(P＜0.01)；C-siRNA组和M-siRNA组β-catenin显著降低，P-β-catenin显著升高(P＜0.05,P＜0.01)。与M-JSF组比较C-JSF组β-catenin和P-β-catenin蛋白表达显著降低(P＜0.05,P＜0.01)；M-siRNA组P-β-catenin蛋白表达显著降低(P＜0.05)。与C-siRNA组比较，NC-siRNA组β-catenin蛋白表达显著升高，P-β-catenin蛋白表达显著降低(P＜0.01)。
与Control组比较，C-JSF组Wnt-1蛋白表达显著降低(P＜0.01)；C-PND组Wnt-1和DKK-1显著降低，GSK-3显著升高(P＜0.05,P＜0.01)；C-siRNA组Wnt-1蛋白表达显著降低(P＜0.01)；Model组Wnt-1蛋白表达显著升高，GSK-3β和DKK-1显著降低(P＜0.05,P＜0.01)。与Model组比较，C-siRNA组、M-siRNA组和M-PND组Wnt-1蛋白表达显著降低，GSK-3β和DKK-1显著升高(P＜0.05,P＜0.01)；M-JSF组Wnt-1显著降低，DKK-1显著升高(P＜0.05,P＜0.01)。与M-JSF组比较，C-JSF组和M-siRNA组Wnt-1和DKK-1蛋白表达显著降低(P＜0.01)；M-PND组DKK-1蛋白表达显著降低(P＜0.01)。与C-siRNA组比较，NC-siRNA组Wnt-1和DKK-1表达显著升高(P＜0.01)，GSK-3β蛋白表达显著降低(P＜0.05)。
结论
1成功制备A549细胞上皮间质转化模型，以7.5ng/ml的TGF-β1作用于A549细胞48h，细胞形态明显变为长梭形，细胞增殖显著且增殖作用稳定，细胞分泌α-SMA水平显著升高。
2金水缓纤方可抑制TGF-β1诱导的A549细胞上皮间质转化，减少α-SMA分泌，增加E-cad蛋白表达，减少细胞外基质ColI、ColⅢ和Fn1沉积，增加MMP9蛋白量和MMP9/TIMP-1比值，使细胞外基质分解加剧，减轻EMT进程，其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路活性有关。