中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）是黄渤海海域十分重要的养殖虾类，具有生长速度快、对低温耐性强、品质好等特点。中国对虾“黄海3号”是本实验室经过长期选育而培育出的中国对虾新品种，具有抗逆性强的新特性，能够在较高的氨氮及pH环境下生存。氨氮是衡量水质质量好坏的重要标准，已有研究表明养殖水环境中氨氮含量过高会对对虾的生理机能及对细菌和病毒的的抵抗力有显著的影响，甚至导致对虾非病原感染性死亡。天门冬氨酸氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶是生物体氨基酸分解代谢及氨氮转化和排泄过程中的关键酶，本实验对以上酶基因（天门冬氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶）进行了cDNA全长克隆并对其在氨氮代谢中的作用进行了研究，以期为中国对虾氨氮代谢途径的研究提供依据以及对“黄海3号”抗逆性机制的研究提供实验基础。研究内容包括以下三个部分：第一部分：中国对虾天门冬氨酸转氨酶活性测定及其基因克隆和表达分析。对4mg/L和16mg/L氨氮胁迫下的中国对虾肝胰腺和鳃组织中的天门冬氨酸转氨酶活力进行了测定。结果显示，两胁迫组实验过程中大部分时间酶活力均被抑制。利用RACE技术克隆获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)天门冬氨酸转氨酶GOT基因(FcGOT)。FcGOT基因cDNA全长为1910bp,其中，开放阅读框1284bp,编码427个氨基酸。同源性分析表明，中国对虾天门冬氨酸转氨酶GOT氨基酸序列与其他节肢动物高度保守，与克氏原螯虾(Procambarus clarkii)和桔粉蚧壳虫(Planococcus citri)的同源性分别为78%和73%。系统进化分析表明，FcGOT基因氨基酸序列与克氏原螯虾GOT聚为一支。组织表达分析发现FcGOT基因在肝胰腺、鳃、血细胞、肌肉、心脏、淋巴中均有表达,其中肝胰腺中表达量最高。氨氮胁迫后，荧光定量PCR分析结果表明，FcGOT基因在肝胰腺和鳃组织中的表达与对照组相比具有显著差异(P<0.05)，表明FcGOT基因在氨氮代谢方面具有重要的作用，参与了中国对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。第二部分：中国对虾谷氨酸脱氢酶活性测定及其基因克隆和表达分析。对不同浓度氨氮胁迫后肌肉组织中GDH活性变化进行了测定，结果表明，氨氮能够刺激GDH酶活力增强。实验过程中，两胁迫组的GDH活力均上调，16mg/L组上调的幅度比4mg/L组大。采用RACE技术克隆获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)谷氨酸脱氢酶GDH基因(FcGDH)。FcGDH基因全长1779bp,包括一个1659bp的开放阅读框(ORF)，编码552个氨基酸；同源性分析表明，中国对虾谷氨酸脱氢酶GDH氨基酸序列与其他动物高度保守，其中与南美白对虾最为相似，高达98%；系统进化树分析表明，中国对虾FcGDH氨基酸序列与南美白对虾GDH聚为一支，之后的聚类次序依次为：中华绒螯蟹、黑腹果蝇、埃及按蚊。组织表达分析发现FcGDH基因在肝胰腺、鳃、血淋巴、肌肉、淋巴、胃、肠中均有表达,其中肌肉中表达量最高。这可能跟肌肉组织是蛋白质沉积的主要组织，也可能是氨基酸储存的主要组织有关。氨氮胁迫后,荧光定量PCR分析结果表明，FcGDH基因在肌肉和鳃组织中变化显著，在胁迫后期两胁迫组FcGDH基因表达量均上调，且与对照组相比差异显著（P<0.05），说明FcGDH基因在氨氮解毒代谢过程中发挥了重要作用。第三部分：氨氮胁迫对谷氨酰胺合成酶活力及基因表达的影响。氨氮胁迫后，肝胰腺和肌肉中的GS活力均明显上调；高浓度（16mg/L）氨氮胁迫下肌肉和肝胰腺中GS含量高于低浓度（4mg/L）氨氮胁迫，并随胁迫时间的延长酶活有所上升，说明了GS在合成谷氨酰胺降低体内氨氮毒性方面的作用。对肝胰腺和肌肉组织中的FcGS基因进行荧光定量分析显示，不同氨氮浓度胁迫下肝胰腺和肌肉中FcGS基因均上调，从整体来看，肌肉组织中的FcGS基因表达水平要略高于肝胰腺，这与酶活测定的实验结果一致。以上结果说明谷氨酰胺合成酶对外界氨氮胁迫具有积极的响应，说明谷氨酰胺合成酶在氨氮解毒代谢过程中发挥了重要作用。