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研究背景:颅颌面形态的生长模式,是一个错综复杂的过程,它包括前期的间充质细胞的聚集、细胞的增殖与凋亡以及后期的分化和成骨。Hedgehog基因所编码的蛋白对于胚胎发育、器官形成具有重要的作用。越来越多的证据表明Hedgehog(Hh)信号通路在颅骨的生长发育中具有重要作用。然而大量的研究主要基于基因敲除小鼠的实验,但在某个时间点通过外源性抑制剂特异性的抑制颅骨发育的研究模型相对较少。研究目的:本实验通过Hedgehog通路抑制剂GDC-0449在小鼠额骨发育的敏感时期进行特异性地抑制,探究并构建小鼠额骨缺陷模型,之后对此模型进行观察和分析,并进一步探讨外源性Hedgehog信号通路抑制对额骨发育的影响。研究方法:1.33只SPF级ICR近交系孕鼠随机分为6组,对照组为3只,给药组5组每组6只,每组给药组再按100mg/kg、150mg/kg的剂量随机分成两小组,分别于E8.5、E9.5、E10.5、E11.5、E12.5口饲灌胃单次给药GDC-0449,探索使用GDC-0449诱导额骨缺陷模型的较佳时间点和最佳剂量。使用体视镜、阿尔新蓝茜素红染色和HE组织染色技术观察E16.5胎鼠额骨的发育情况。确定额骨缺陷发生率最高组为实验组。2.对E12.5、E14.5、E16.5的对照组和实验组胎鼠,通过HE染色观察其组织学差异,对E16.5、E18.5的对照组和实验组胎鼠,通过苯胺蓝染色和Micro-CT观察额骨的成骨情况和后期的额骨形态。并通过免疫荧光染色观察Hedgehog信号通路中的相关蛋白表达情况,进一步验证Hedgehog信号通路抑制剂的相关作用。3.利用Wnt1-Cre;Rosa26m Tm G转基因小鼠对E11.5、E12.5、E13.5对照组和实验组胎鼠的颅神经嵴细胞(CNC)的迁移和聚集情况进行观察,并通过冰冻切片进行组织学分析,来探讨早期额骨原基处GDC-0449对其颅神经嵴细胞的迁移和聚集的影响。4.通过免疫组化的方法,对E12.5、E13.5对照组与实验组胎鼠的增殖指标磷酸化组蛋白h3和凋亡指标Cleaved caspase3进行检测,分析GDC-0449对额骨原基处细胞的增殖和凋亡的影响。5.在E12.5、E13.5、E14.5对照组与实验组胎鼠,通过免疫组织化学半定量统计方法对腭骨形成区BMP4、Runx2蛋白的平均光密度值进行分析,分析Hedgehog信号通路与相关成骨蛋白之间的关系。研究结果:1.在以100mg/kg的给药组中均未发现明显的额骨缺陷畸形;E9.5 150mg/kg、E10.5150mg/kg的给药组中胎鼠均出现明显的额骨发育缺陷的畸形,但E9.5 150mg/kg给药组孕鼠致死率和死胎数较高;2.实验组中胎鼠额骨的成骨较少,额缝增宽,而且GDC-0449对胎鼠额骨发育中的Hedgehog信号通路具有明显的抑制作用。3.在E11.5、E12.5、E13.5的实验组中,额骨原基的颅神经嵴细胞的迁移的聚集出现了较明显的较少。4.在E12.5、E13.5的实验组中,额骨原基处增殖活性细胞百分数明显降低,细胞凋亡活性增强。5.通过对额骨成骨蛋白的平均光密度进行半定量分析,我们发现实验组在E13.5、E14.5,Runx2的表达较对照组出现较明显的下降,且具有统计学差异,而实验组在E12.5、E13.5,BMP4表达与对照组无明显统计学差异。结论:1.Hedgehog信号通路抑制剂GDC-0449可以在额骨发育的关键时间点特异性地抑制Hedgehog信号来诱导额骨发育缺陷。2.GDC-0449不仅抑制早期额骨原基中颅神经嵴细胞的迁移和聚集,而且还会影响额骨前体细胞增殖凋亡以及分化成骨能力,导致额骨前体细胞增殖和分化成骨能力下降,凋亡能力增加,进而引起额骨发育缺陷。