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细菌在其生长和繁殖过程中,进化产生了七种不同类型的分泌系统(Ⅰ-Ⅶ型)。Ⅵ型分泌系统(T6SS)是最近几年发现的一类结构复杂的接触依赖型的效应蛋白分泌途径。该系统主要是通过其复杂的结构接触细菌或真核靶细胞,将一些效应蛋白分泌进入靶细胞内部。目前研究发现Ⅵ型分泌系统的主要功能有:(ⅰ)介导细菌与宿主细胞之间的相互作用;(ⅱ)参与细菌和细菌之间的“战争”;(ⅲ)增强细菌自身对极端环境适应的能力。因此,揭示Ⅵ型分泌系统不同亚型的生物学功能对降低病原微生物感染具有重大的意义。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是一种广泛分布的机会致病菌。在医院中极易感染免疫能力低下的病人,并且往往造成重大感染威胁患者的生命。铜绿假单胞菌中存在三种亚型的T6SS,分别为H1-T6SS、H2-T6SS和H3-T6SS,其中H1-T6SS的功能及其效应蛋白已经被广泛研究。对于H2-T6SS和H3-T6SS的效应蛋白的鉴定仍然不多。在前期的研究中揭示铜绿假单胞菌的H2-T6SS能够通过分泌效应蛋白增加自身在细菌-细菌竞争中的优势,但是关于具体的分子机制还知之甚少。本研究以铜绿假单胞菌为模式菌,以H2-T6SS为研究对象,利用分泌蛋白质组学、实时定量PCR、体外GSTPullDown、体内免疫共沉淀等实验手段,以期揭示铜绿假单胞菌的H2-T6SS在细菌-细菌竞争中的调控机制。主要研究如下:
1.在铜绿假单胞菌中建立感受器激酶RetS在不同生长条件下负调控H2-T6SS的表达。在LB培养基中,缺失retS后发现H2-T6SS的结构组分蛋白(Hcp2、VgrG2b)和已知效应蛋白PldA的分泌水平显著上调。同时,我们在缺失retS背景下突变H2-T6SS的核心功能基因clpV2之后,H2-T6SS相关的蛋白分泌水平恢复至野生型水平。M9培养基中得到相同的结果。接下来,通过分泌蛋白质组学筛选鉴定依赖H2-T6SS的效应蛋白。
2.通过对分泌蛋白质组学数据的分析,我们发现了依赖H2-T6SS分泌的效应蛋白Azu。进一步研究发现Azu主要通过与运载工具蛋白VgrG2b结合被H2-T6SS分泌至胞外。同时,我们发现H2-T6SS对Azu的分泌不依赖Sec转运系统。我们的结果还表明,Azu和H2-T6SS的表达和装配受到Cu2+浓度的调控。低浓度Cu2+能够激活Azu和H2-T6SS的表达,同时增加H2-T6SS的装配活性;而高浓度的Cu2+会抑制Azu和H2-T6SS的表达和装配。深入研究发现,H2-T6SS的表达受到铜离子浓度响应蛋白CueR的调控。CueR能够在高Cu2+时与H2-T6SS的启动子区域结合抑制基因表达;当细胞处于低Cu2+浓度时,CueR能够减少对H2-T6SS的抑制作用。同时我们发现,铜绿假单胞菌在不同浓度的Cu2+环境中通过改变H2-T6SS对Azu的表达分泌,从而增加自身的竞争能力。
3.我们确定了与Azu相互作用的膜受体蛋白OprC。OprC是一种Cu2+特异性的TonB依赖性外膜转运蛋白。OprC受不同浓度Cu2+的调控。进一步研究发现,这种调控作用也是由CueR介导的。此外,还确定了Azu-OprC介导的Cu2+转运系统在铜绿假单胞菌毒力及细菌竞争活动中的重要作用。我们的研究丰富了T6SS的调控机制,并就铜绿假单胞菌在细菌-细菌竞争中的金属离子的作用提供了新的见解。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是一种广泛分布的机会致病菌。在医院中极易感染免疫能力低下的病人,并且往往造成重大感染威胁患者的生命。铜绿假单胞菌中存在三种亚型的T6SS,分别为H1-T6SS、H2-T6SS和H3-T6SS,其中H1-T6SS的功能及其效应蛋白已经被广泛研究。对于H2-T6SS和H3-T6SS的效应蛋白的鉴定仍然不多。在前期的研究中揭示铜绿假单胞菌的H2-T6SS能够通过分泌效应蛋白增加自身在细菌-细菌竞争中的优势,但是关于具体的分子机制还知之甚少。本研究以铜绿假单胞菌为模式菌,以H2-T6SS为研究对象,利用分泌蛋白质组学、实时定量PCR、体外GSTPullDown、体内免疫共沉淀等实验手段,以期揭示铜绿假单胞菌的H2-T6SS在细菌-细菌竞争中的调控机制。主要研究如下:
1.在铜绿假单胞菌中建立感受器激酶RetS在不同生长条件下负调控H2-T6SS的表达。在LB培养基中,缺失retS后发现H2-T6SS的结构组分蛋白(Hcp2、VgrG2b)和已知效应蛋白PldA的分泌水平显著上调。同时,我们在缺失retS背景下突变H2-T6SS的核心功能基因clpV2之后,H2-T6SS相关的蛋白分泌水平恢复至野生型水平。M9培养基中得到相同的结果。接下来,通过分泌蛋白质组学筛选鉴定依赖H2-T6SS的效应蛋白。
2.通过对分泌蛋白质组学数据的分析,我们发现了依赖H2-T6SS分泌的效应蛋白Azu。进一步研究发现Azu主要通过与运载工具蛋白VgrG2b结合被H2-T6SS分泌至胞外。同时,我们发现H2-T6SS对Azu的分泌不依赖Sec转运系统。我们的结果还表明,Azu和H2-T6SS的表达和装配受到Cu2+浓度的调控。低浓度Cu2+能够激活Azu和H2-T6SS的表达,同时增加H2-T6SS的装配活性;而高浓度的Cu2+会抑制Azu和H2-T6SS的表达和装配。深入研究发现,H2-T6SS的表达受到铜离子浓度响应蛋白CueR的调控。CueR能够在高Cu2+时与H2-T6SS的启动子区域结合抑制基因表达;当细胞处于低Cu2+浓度时,CueR能够减少对H2-T6SS的抑制作用。同时我们发现,铜绿假单胞菌在不同浓度的Cu2+环境中通过改变H2-T6SS对Azu的表达分泌,从而增加自身的竞争能力。
3.我们确定了与Azu相互作用的膜受体蛋白OprC。OprC是一种Cu2+特异性的TonB依赖性外膜转运蛋白。OprC受不同浓度Cu2+的调控。进一步研究发现,这种调控作用也是由CueR介导的。此外,还确定了Azu-OprC介导的Cu2+转运系统在铜绿假单胞菌毒力及细菌竞争活动中的重要作用。我们的研究丰富了T6SS的调控机制,并就铜绿假单胞菌在细菌-细菌竞争中的金属离子的作用提供了新的见解。