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乳腺癌是女性最常见的癌症，也是女性癌症死亡的主要原因。目前药物治疗存在耐药性，转移、晚期、难治性乳腺癌仍缺乏有效治疗手段。肿瘤相关的基因治疗发展迅速，其中，腺病毒(Adenovirus,Ad)载体是肿瘤基因治疗最常用的载体之一，主要分为条件复制型腺病毒和复制缺陷型腺病毒。溶瘤腺病毒属于条件复制型腺病毒，可以在肿瘤细胞中选择性复制并溶解肿瘤细胞，不影响正常细胞。但肿瘤微环境中存在抑制性免疫细胞，可抵消溶瘤病毒裂解肿瘤细胞后产生的免疫效应，抑制溶瘤腺病毒发挥作用。使用溶瘤腺病毒搭载免疫基因，可以激活机体免疫系统，增强溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用。LIGHT是肿瘤坏死因子配体家族成员，在T细胞稳态和增殖中发挥关键作用，可选择性地诱导某些肿瘤细胞如同时表达淋巴毒素β受体(LTβR)和TR2/HVEM受体的肿瘤细胞凋亡，如231细胞，HT-29细胞，TIL1200。目前，LIGHT基因对乳腺癌的作用尚未有研究。因此，本研究的目的是评价溶瘤腺病毒rAd.Light对乳腺癌的治疗效果并初步阐明其作用机制。
首先我们需要获得rAd.light、rAd.Null、Ad.light和Ad.Null四种病毒。实验室前期已经构建了rAd.light、rAd.Null、Ad.light和Ad.Null四种重组腺病毒，并且已制备rAd.Null和Ad.Null两种对照病毒。在此基础上，我们对rAd.light和Ad.light病毒进行了扩增，并利用氯化铯密度梯度法进行纯化。采用分光光度法测定病毒颗粒滴度(virus particle,vp)，rAd.light为1.2×1013vps/mL，rAd.Null为1.3×1012vps/mL，Ad.light为1.4×1013vps/mL，Ad.Null为1.4×1012vps/mL。通过半数组织培养物感染剂量法（TCID50）测定病毒感染滴度（每毫升感染单位（IU）），rAd.light为1.8×109IU/mL，rAd.Null为8×109IU/mL，Ad.light为2.5×109IU/mL，Ad.Null为8×109IU/mL。上述结果表明，我们已经成功获得了纯度与滴度均满足后续实验的病毒。
其次，我们检测了Light对乳腺癌细胞增殖和凋亡影响。小鼠乳腺癌细胞系4T1细胞分别感染Ad.Light和rAd.Light，感染48h后采用流式细胞术检测LIGHT蛋白的表达情况，检测结果表明，两种病毒均可很好地介导4T1细胞表达LIGHT。4T1细胞分别感染Ad.Light和Ad.Null，感染48h后利用CCK8法检测LIGHT对4T1细胞增殖的影响。结果表明，与Ad.Null组相比，Ad.Light组4T1细胞存活率降低，表明LIGHT可以抑制4T1细胞的增殖。用不同颗粒滴度的Ad.Light和Ad.Null感染4T1细胞，感染48h后，流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果表明，与对照Ad.Null组相比，Ad.Light组细胞凋亡比例更高，且随着病毒颗粒滴度的增加，细胞凋亡比例增加。因此，我们推测LIGHT可能通过抑制肿瘤生长，同时促进细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。
然后，对rAd.Light治疗乳腺癌移植瘤的疗效进行评价。我们使用小鼠乳腺癌4T1细胞，小鼠背部皮下注射的方法建立小鼠乳腺癌移植瘤模型，注射剂量为1×106细胞/只小鼠。荷瘤后第7天对小鼠进行随机分组，分为buffer对照组，rAd.Null和rAd.Light两个治疗组。在荷瘤后第7和10天分别进行肿瘤瘤内给药，治疗组病毒给药剂量为2.5×1010vps/次/只小鼠，buffer组注射200μL的PBS。荷瘤后第7、14、18、21、25天记录肿瘤体积变化。荷瘤后第25天处死小鼠，取肿瘤组织，测量瘤重；HE染色进行组织病理学分析。结果表明，溶瘤腺病毒rAd.Null或rAd.Light均可抑制4T1移植瘤模型中肿瘤的生长，与rAd.Null组相比，rAd.Light对肿瘤生长的抑制作用更强。HE染色后可观察到溶瘤腺病毒治疗组肿瘤坏死面积增大，且rAd.Light组效果更明显。上述结果表明rAd.Light可促进肿瘤细胞坏死，抑制肿瘤生长。
最后，对rAd.Light治疗乳腺癌移植瘤的机制进行初步研究。荷瘤后第15和19天取外周血检测T淋巴细胞表型改变。荷瘤后第25天处死小鼠，取肿瘤组织，免疫组化检测CD3和Caspase-3的表达（包括CD3、CD4、CD8、Treg、Tmemory）；提取RNA，通过实时定量PCR法检测LIGHT受体（包括LTβR和HVEM）、Th1型细胞因子（包括IL-2、IFN-γ和TNF-α）和Th2型细胞因子（包括TGF-β和IL-10）的表达情况。肿瘤组织免疫组化分析结果显示，治疗组CD3+T细胞浸润比例增加，caspase3阳性凋亡细胞比例增加，且rAd.Light组比例更高。实时定量PCR结果显示，溶瘤腺病毒治疗后LIGHT受体LTβR和HVEM表达均升高，且rAd.Light组比rAd.Null组升高更明显，二者之间的差异具有统计学意义。Th1型细胞因子表达上调，Th2型细胞因子表达下调，且与rAd.Null组相比，rAd.Light组调节作用更强。流式细胞术检测小鼠外周血T淋巴细胞，可看到溶瘤病毒治疗后CD4+T淋巴细胞比例下调，CD8+T淋巴细胞比例上调。且与rAd.Null组相比，rAd.Light组出现时间更早，作用更强。rAd.Light治疗后CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例降低。此外，我们还发现溶瘤腺病毒治疗后CD62LHighCD44+记忆T细胞百分比上调，且rAd.Light组发挥作用时间更早，效果更强。上述结果表明，rAd.Light通过促进肿瘤局部CD3+细胞浸润，肿瘤细胞凋亡，LIGHT及受体表达，调节Th1/Th2细胞因子平衡，从而调节肿瘤局部微环境；通过增加CD8+T淋巴细胞比例、促进CD4+T记忆细胞、减少调节性T细胞，从而增强机体抗肿瘤免疫反应。
综上所述，LIGHT和溶瘤腺病毒均可诱导乳腺癌细胞的凋亡和死亡。在小鼠乳腺癌皮下移植瘤模型中，rAd.Light通过诱导肿瘤细胞凋亡和死亡，引起强烈的抗肿瘤免疫反应，包括诱导Treg下调、激活记忆T细胞、增强Th1细胞因子的表达和抑制Th2细胞因子的表达。因此，rAd.Light作为一种有效的治疗乳腺癌的方法，具有广阔的发展前景。
首先我们需要获得rAd.light、rAd.Null、Ad.light和Ad.Null四种病毒。实验室前期已经构建了rAd.light、rAd.Null、Ad.light和Ad.Null四种重组腺病毒，并且已制备rAd.Null和Ad.Null两种对照病毒。在此基础上，我们对rAd.light和Ad.light病毒进行了扩增，并利用氯化铯密度梯度法进行纯化。采用分光光度法测定病毒颗粒滴度(virus particle,vp)，rAd.light为1.2×1013vps/mL，rAd.Null为1.3×1012vps/mL，Ad.light为1.4×1013vps/mL，Ad.Null为1.4×1012vps/mL。通过半数组织培养物感染剂量法（TCID50）测定病毒感染滴度（每毫升感染单位（IU）），rAd.light为1.8×109IU/mL，rAd.Null为8×109IU/mL，Ad.light为2.5×109IU/mL，Ad.Null为8×109IU/mL。上述结果表明，我们已经成功获得了纯度与滴度均满足后续实验的病毒。
其次，我们检测了Light对乳腺癌细胞增殖和凋亡影响。小鼠乳腺癌细胞系4T1细胞分别感染Ad.Light和rAd.Light，感染48h后采用流式细胞术检测LIGHT蛋白的表达情况，检测结果表明，两种病毒均可很好地介导4T1细胞表达LIGHT。4T1细胞分别感染Ad.Light和Ad.Null，感染48h后利用CCK8法检测LIGHT对4T1细胞增殖的影响。结果表明，与Ad.Null组相比，Ad.Light组4T1细胞存活率降低，表明LIGHT可以抑制4T1细胞的增殖。用不同颗粒滴度的Ad.Light和Ad.Null感染4T1细胞，感染48h后，流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果表明，与对照Ad.Null组相比，Ad.Light组细胞凋亡比例更高，且随着病毒颗粒滴度的增加，细胞凋亡比例增加。因此，我们推测LIGHT可能通过抑制肿瘤生长，同时促进细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。
然后，对rAd.Light治疗乳腺癌移植瘤的疗效进行评价。我们使用小鼠乳腺癌4T1细胞，小鼠背部皮下注射的方法建立小鼠乳腺癌移植瘤模型，注射剂量为1×106细胞/只小鼠。荷瘤后第7天对小鼠进行随机分组，分为buffer对照组，rAd.Null和rAd.Light两个治疗组。在荷瘤后第7和10天分别进行肿瘤瘤内给药，治疗组病毒给药剂量为2.5×1010vps/次/只小鼠，buffer组注射200μL的PBS。荷瘤后第7、14、18、21、25天记录肿瘤体积变化。荷瘤后第25天处死小鼠，取肿瘤组织，测量瘤重；HE染色进行组织病理学分析。结果表明，溶瘤腺病毒rAd.Null或rAd.Light均可抑制4T1移植瘤模型中肿瘤的生长，与rAd.Null组相比，rAd.Light对肿瘤生长的抑制作用更强。HE染色后可观察到溶瘤腺病毒治疗组肿瘤坏死面积增大，且rAd.Light组效果更明显。上述结果表明rAd.Light可促进肿瘤细胞坏死，抑制肿瘤生长。
最后，对rAd.Light治疗乳腺癌移植瘤的机制进行初步研究。荷瘤后第15和19天取外周血检测T淋巴细胞表型改变。荷瘤后第25天处死小鼠，取肿瘤组织，免疫组化检测CD3和Caspase-3的表达（包括CD3、CD4、CD8、Treg、Tmemory）；提取RNA，通过实时定量PCR法检测LIGHT受体（包括LTβR和HVEM）、Th1型细胞因子（包括IL-2、IFN-γ和TNF-α）和Th2型细胞因子（包括TGF-β和IL-10）的表达情况。肿瘤组织免疫组化分析结果显示，治疗组CD3+T细胞浸润比例增加，caspase3阳性凋亡细胞比例增加，且rAd.Light组比例更高。实时定量PCR结果显示，溶瘤腺病毒治疗后LIGHT受体LTβR和HVEM表达均升高，且rAd.Light组比rAd.Null组升高更明显，二者之间的差异具有统计学意义。Th1型细胞因子表达上调，Th2型细胞因子表达下调，且与rAd.Null组相比，rAd.Light组调节作用更强。流式细胞术检测小鼠外周血T淋巴细胞，可看到溶瘤病毒治疗后CD4+T淋巴细胞比例下调，CD8+T淋巴细胞比例上调。且与rAd.Null组相比，rAd.Light组出现时间更早，作用更强。rAd.Light治疗后CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例降低。此外，我们还发现溶瘤腺病毒治疗后CD62LHighCD44+记忆T细胞百分比上调，且rAd.Light组发挥作用时间更早，效果更强。上述结果表明，rAd.Light通过促进肿瘤局部CD3+细胞浸润，肿瘤细胞凋亡，LIGHT及受体表达，调节Th1/Th2细胞因子平衡，从而调节肿瘤局部微环境；通过增加CD8+T淋巴细胞比例、促进CD4+T记忆细胞、减少调节性T细胞，从而增强机体抗肿瘤免疫反应。
综上所述，LIGHT和溶瘤腺病毒均可诱导乳腺癌细胞的凋亡和死亡。在小鼠乳腺癌皮下移植瘤模型中，rAd.Light通过诱导肿瘤细胞凋亡和死亡，引起强烈的抗肿瘤免疫反应，包括诱导Treg下调、激活记忆T细胞、增强Th1细胞因子的表达和抑制Th2细胞因子的表达。因此，rAd.Light作为一种有效的治疗乳腺癌的方法，具有广阔的发展前景。