论文部分内容阅读
七鳃鳗在进化上处于尾索动物与有颌类脊椎动物之间，是脊椎动物的祖先。由于进化地位的独特性，它可作为揭示脊椎动物适应性免疫系统起源和进化的关键物种。为深入了解七鳃鳗补体第三组分(Lamprey third complement component, LC3)的进化和分子功能，本文对LC3及有颌脊椎动物的C3进行了包括系统发育分析、基序分析、共线性分析在内的一系列生物信息学分析。进化树、基序组成和基因结构分析发现LC3分子处于脊椎动物类群中较为原始的进化地位且具有向有颌脊椎动物C3进化的趋势。功能结构域组成和三维结构预测表明LC3与人C3(HC3)相似且一致性为35%。高等哺乳动物基因组中，C3与GPR108、TNFSF14紧密连锁。共线性分析显示LC3所在的染色体区段基因排列较为松散，由此我们推测，漫长的进化过程中七鳃鳗基因组可能发生染色体重排或同源重组等进化事件。
鉴于嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila, A.hydrophila)的致病性，以月龄东北七鳃鳗为实验材料，先通过设定不同感染浓度，经梯度实验得出A.hydrophila感染幼鳗的最适浓度为107cfu/mL。Q-PCR和免疫荧光检测发现感染后幼鳗体内LC3mRNA和蛋白表达量比感染前显著升高，暗示LC3参与抵御病原菌入侵的免疫学过程。利用显微注射手段获得了ControlMOF0、LC3MOF0月龄幼鳗，Westernblotting检测LC3沉默效率为37.8%，证实沉默手段有效。之后以107cfu/mLA.hydrophila对LC3MO幼鳗进行感染，结果显示LC3敲低个体抵抗病原菌入侵的能力弱于对照，暗示LC3的敲低会影响七鳃鳗抵御病原菌入侵的能力。再以Q-PCR检测WT、LC3MO、WTA.hydrophila、ControlMOA.hydrophila及LC3MOA.hydrophila五组的VLRA＋、VLRB＋、VLRC＋淋巴细胞表达谱中一系列基因mRNA的表达量。与对照相比，结果显示LC3的敲低会显著降低部分与VLRA＋、VLRB＋、VLRC＋淋巴细胞分化发育和活化调节的相关基因的表达。对VLRA、VLRB、VLRC蛋白表达情况的检测进一步证实LC3的敲低对三种淋巴细胞的活化增殖影响程度不同，且主要影响VLRA＋和VLRC＋淋巴细胞生理活性。
鉴于嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila, A.hydrophila)的致病性，以月龄东北七鳃鳗为实验材料，先通过设定不同感染浓度，经梯度实验得出A.hydrophila感染幼鳗的最适浓度为107cfu/mL。Q-PCR和免疫荧光检测发现感染后幼鳗体内LC3mRNA和蛋白表达量比感染前显著升高，暗示LC3参与抵御病原菌入侵的免疫学过程。利用显微注射手段获得了ControlMOF0、LC3MOF0月龄幼鳗，Westernblotting检测LC3沉默效率为37.8%，证实沉默手段有效。之后以107cfu/mLA.hydrophila对LC3MO幼鳗进行感染，结果显示LC3敲低个体抵抗病原菌入侵的能力弱于对照，暗示LC3的敲低会影响七鳃鳗抵御病原菌入侵的能力。再以Q-PCR检测WT、LC3MO、WTA.hydrophila、ControlMOA.hydrophila及LC3MOA.hydrophila五组的VLRA＋、VLRB＋、VLRC＋淋巴细胞表达谱中一系列基因mRNA的表达量。与对照相比，结果显示LC3的敲低会显著降低部分与VLRA＋、VLRB＋、VLRC＋淋巴细胞分化发育和活化调节的相关基因的表达。对VLRA、VLRB、VLRC蛋白表达情况的检测进一步证实LC3的敲低对三种淋巴细胞的活化增殖影响程度不同，且主要影响VLRA＋和VLRC＋淋巴细胞生理活性。