论文部分内容阅读
间质在肿瘤发生发展中的作用越来越受到重视,现已成为当今肿瘤研究的一个热门话题。鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是我国南方常见的一种上皮性恶性肿瘤,其发病率和死亡率均居世界首位,严重危害国人的生命和健康。为了从蛋白质组水平探讨间质细胞在肿瘤发生发展过程中的作用及其机制,本研究采用激光捕获显微切割（laser capture microdissection,LCM）技术分别从活检的NPC组织和正常鼻咽粘膜（normalnasopharyngal mucosa,NNM）组织中切割纯化NPC间质和NNM间质,应用荧光差异双向凝胶电泳（Fluorescent two-dimensional difference gelelectrophoresis,2D-DIGE）结合质谱技术分离、鉴定间质相关蛋白。建立了LCM纯化的NPC间质和NNM间质蛋白的荧光差异蛋白表达图谱,高通量筛选与肿瘤发生发展相关的间质蛋白,共得到34个有统计学意义的蛋白质点,质谱鉴定得到20个差异蛋白。其中在NPC间质中高表达的蛋白有Periostin,S100A9,CapG,PYCARD等,低表达的蛋白有L-plastin,Rho-GDI-β,B23,hnRNP K等。采用Western blot验证了其中部分差异蛋白（Periostin,S100A9,CapG,L-plastin）在NPC和NNM组织中的表达水平,证实了2D-DIGE结果的可靠性。为探讨NPC间质差异表达蛋白质的功能和临床病理学意义,采用免疫组织化学染色检测部分差异蛋白质在存档石蜡包埋组织（30例正常鼻咽粘膜上皮组织、66例原发NPC及20例颈淋巴结转移NPC）中的表达,统计学分析差异蛋白质表达水平与临床病理特征的关系。结果显示:Periostin,S100A9和CapG在NPC组织中的表达较NNM组织中明显上调（p<0.01）,L-plastin在NPC组织中的表达较NNM组织中明显下调（p<0.01）;Periostin和S100A9在颈淋巴结转移NPC中的表达较原发NPC明显上调（p<0.05）,CapG和L-plastin在颈淋巴结转移鼻咽癌中的表达与原发鼻咽癌比较无显著差异（p>0.05）。统计学分析显示:Periostin,S100A9,CapG上调和L-plastin下调与NPC组织学分化及临床分期相关（p<0.01）,Periostin和S100A9上调还与NPC淋巴结转移密切相关（p<0.01）。为进一步探讨NPC间质差异表达蛋白质的功能和临床病理学意义,本研究选取差异蛋白质Periostin为研究对象,首先采用Western blot检测其在不同分化程度或转移潜能的NPC细胞（CNE1、CNE2、5-8F和6-10B）及NIH 3T3成纤维细胞中的表达水平,结果发现Periostin在CNE1、CNE2、6-10B和3T3细胞中不表达,在5-8F细胞中弱表达。随后采用脂质体转染方法将真核表达载体pCMV-neo（+）-Periostin及其相应空白载体pCMV-neo（+）转染6-10B细胞（低转移潜能细胞）,建立稳定表达Periostin的细胞系,同时将pCMV-neo（+）-Periostin及其相应空白载体pCMV-neo（+）瞬时转染NIH3T3成纤维细胞。然后以稳定转染6-10B细胞及瞬时转然的NIH 3T3细胞为样本,观察6-10B细胞中Periostin高表达后的细胞生物学特性的改变及对基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）活性的影响。研究结果如下:成功建立了稳定表达Periostin的6-10B细胞系(6-10Bperiostin)和空白载体转染的6-10B细胞系(6-10Bvector)。生物学特性分析结果显示:（1）与对照组细胞比较,6-10Bperiostin细胞周期进程加快,G1期减少,S期、G2期增加;（2）高表达Periostin的6-10B细胞较对照组细胞生长速度明显加快;（3）6-10Bperiostin细胞的平板集落形成数明显增多;（4）6-10Bperiostin细胞的软琼脂集落形成率显著提高;（5）6-10Bperiostin细胞的侵袭、迁移能力明显增强;（6）明胶酶谱实验显示,与对照组细胞比较,Periostin高表达的细胞分泌的MMP-2、MMP-9活性增加。接着用免疫组织化学的方法检测了αvβ5整合素（integrinαvβ5）在NPC和NNM组织、6-10Bperiostin和6-10Bvector、6-10B细胞中的表达水平,发现integrinαvβ5在NPC组织和6-10Bperiostin细胞中表达均较对照组增强,Spearman相关性分析显示integrinαvβ5和Periostin在NPC组织中的表达强度呈正相关（r=0.682,p=0.000）。结果提示:Periostin可能是通过与NPC细胞膜上integrinαvβ5受体结合来促进肿瘤细胞的生长,提高MMPs的活性,促进肿瘤细胞的侵袭和转移。综上所述,本研究采用LCM结合定量蛋白质组学技术从NPC间质和NNM间质中筛选到20个差异蛋白,并通过临床病理标本到细胞模型对差异蛋白Periostin的功能及作用机理进行了探讨。实验结果显示periostin在NPC病程演进中发挥正向调控作用:Periostin与NPC的分化程度、转移相关,Periostin高表达可促进NPC的侵袭和转移,Periostin可能通过与NPC细胞膜上的integrin-αvβ5受体结合发挥其功能。Periostin促进NPC转移与其影响MMPs的活性有关。研究结果提示:这些差异表达的蛋白将有助于阐明鼻咽癌细胞和周围间质的关系,对间质蛋白功能的进一步研究,将有助于解析间质在肿瘤发生发展中的作用并为从间质途径寻找肿瘤治疗靶标提供新思路。