研究背景腰椎管狭窄症（lumbar spinal canal stenosis,LSS）是指由各种先天或后天因素导致腰椎管绝对或相对狭窄,进而刺激压迫马尾神经或脊神经根引起神经组织的广泛病理变化,而产生一系列神经功能障碍的疾病。虽然LSS分为先天性和获得性,但临床中以退行性腰椎管狭窄症（Degenerative Lumbar Spinal Stenosis,DLSS）最为常见。DLSS作为仅次于腰椎间盘突出症的第二大椎管内疾病,其人群发病率约在3.9%～1 1%之间,而在60岁以上人群中的患病率可高达19.4%,且有随着年龄增长而增高的趋势。在我国人口老龄化的大背景下,该病在日益严重威胁中老年人群的生活质量和身心健康同时,也给社会造成很大的经济负担。因此,如何在该病的发展进程中予以有效的治疗措施,改善患者的临床症状,已成为临床医生和患者的迫切需求。保守治疗作为绝大多数DLSS患者的首选治疗方案,主要包括休息、药物治疗、中医传统疗法等。其中,中医疗法在我国已逐渐成为DLSS保守治疗的重要方法。本研究以《黄帝内经》中的“阳化气,阴成形”理论为指导,结合清代医家陈士铎治疗腰痛病“脾肾同补、痰瘀共治”的辨证思路,在古方转腰汤的基础上进行化裁来治疗DLSS（脾肾气虚,痰瘀互结证）,旨在验证转腰汤治疗DLSS的临床疗效以及安全性。但目前中药治疗DLSS的研究多停留在临床层面,缺乏临床与基础研究的相互印证,这也严重制约了中药在DLSS临床治疗中的进一步推广和应用。因此,本次研究将首先从临床出发为转腰汤治疗DLSS提供可靠的临床证据,然后在临床治疗有效的基础上通过动物实验从分子层面探索转腰汤治疗DLSS的作用机制,旨在为中药防治DLSS的机制研究提供分子水平的科学证据。研究内容试验一:转腰汤治疗退行性腰椎管狭窄症的病例系列研究目的:观察转腰汤治疗DLSS（脾肾气虚,痰瘀互结证）的临床疗效和安全性,并分析影响转腰汤治疗DLSS临床疗效的相关因素。方法:从2019年10月至2021年11月,在中国中医科学望京医院脊柱科门诊共纳入116例符合纳排标准的DLSS（脾肾气虚,痰瘀互结证）患者。所有患者予以转腰汤口服治疗,两周一疗程,连续治疗4个疗程。在治疗前收集所有患者的一般情况,包括社会人口学信息、病情信息和影像学信息;同时在治疗前、治疗结束时和治疗结束1个月共3个时点,采集患者Oswestry功能障碍指数（Oswestry disability index,ODI）、疼痛视觉模拟评分（Visual analogue scales,VAS）、中医证候评分以及间歇性跛行程度、下肢痛性痉挛频率和下肢发凉程度等,同时记录治疗期间的不良反应。将治疗后患者根据其临床疗效分为治疗有效组和治疗无效组,通过二元Logistic回归分析可能影响转腰汤治疗DLSS（脾肾气虚,痰瘀互结证）的相关因素。结果:治疗过程中,有12例患者脱落,有104例患者完成治疗和随访。（1）对入组前的一般情况分析,主要包括患者的性别、年龄、身高、体重、病程、主诉、间歇性跛行程度、下肢痛性痉挛频率、下肢发凉程度、影像学信息、ODI评分、VAS评分、中医证候评分。（2）临床疗效及安全性分析:治疗后和随访期的ODI评分、VAS评分和中医证候评分与治疗前比较,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;经治疗后患者间歇性跛行程度、下肢痛性痉挛频率以及下肢发凉程度与治疗前比较,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;治疗后和随访期的临床有效率分别为75.96%和72.12%;在治疗过程中所有患者均未出现明显不良反应。（3）影响疗效的相关因素分析:通过二元Logistic回归分析,患者的年龄、BMI、治疗前ODI评分、治疗前VAS评分、治疗前中医证候积分对转腰汤治疗DLSS的疗效影响不显著（P＞0.05）,而患者的病程、腰椎管狭窄的节段数、间歇性跛行程度是影响转腰汤治疗DLSS疗效的相关因素（P＜0.05）。结论:转腰汤治疗DLSS（脾肾气虚,痰瘀互结证）具有较好的临床疗效和安全性,能有效改善DLSS患者腰腿疼痛、腰椎功能、中医证候、间歇性跛行、下肢痛性痉挛和下肢发凉等症状。另外,通过分析表明病程越长、腰椎管狭窄的节段数越多以及间歇性跛行程度越严重的DLSS患者转腰汤治疗的效果越差。实验二:腰椎管狭窄症大鼠模型的建立及机制探索目的:建立稳定可靠的慢性压迫LSS大鼠实验模型,并从组织病理学层面对LSS的发病机制进行探索。方法:将64只SD大鼠随机分为假手术组和模型组,每组各32只。模型组大鼠的建立方法:将两块4.0mm×1.0mm×1.0mmm的硅胶块分别置入L5和L6椎板下和硬膜外间隙。假手术组则暴露L5/L6、L6/S1椎间隙,并刺破黄韧带,但不塞入硅胶块。（1）腰椎核磁扫描:在造模后第3天,通过核磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging,MRI）观察硅胶块在椎管中的位置。（2）行为学评价:在术前1天,术后第1天、第3天、第1周、第2周、第4周、第8周、第12周,分别对两组大鼠进行转棒测试、电子Von Frey足底痛觉测定和足底热辐射痛阈值的测定。（3）组织病理学观察:分别在造模后第2、4、8、12周各处死大鼠16只,取出L5-L6节段的马尾神经和对应节段两侧的背根神经节（Dorsal Root Ganglion,DRG）。通过固蓝染色（Luxol Fast Blue,LFB）和透射电子显微镜观察马尾神经组织结构变化,通过TUNEL荧光检测观察DRG中细胞凋亡水平,并通过透射电子显微镜观察DRG的微管结构变化。结果:假手术组和模型组大鼠在术后均存活。（1）影像学观察:从MRI的T2加权像观察所有大鼠胶块的位置正对齐L5节段和L6节段,且位于硬膜外腔,没有破坏硬膜囊。（2）行为学评价:术前两组大鼠在转棒上行走时间、足底机械刺痛的作用力和作用时间、足底热辐射痛阈值差异无统计学意义（P＞0.05）。术后各时间点假手术组大鼠在转棒上行走时间、足底机械刺痛的作用力和作用时间、足底热辐射痛阈值与术前比较均无统计学差异（P＞0.05）。模型组大鼠从术后第1天开始在转棒上行走时间、足底机械刺痛的作用力和作用时间、足底热辐射痛阈值呈逐渐下降的趋势,直到术后第8、12周达到一个稳定状态。在术后的各个观察时点两组大鼠间在转棒上行走时间、足底机械刺痛的作用力和作用时间、足底热辐射痛阈值均存在显著统计学差异（P＜0.05）。（3）组织病理学结果:①假手术组各时间点轴突髓鞘化程度无统计学差异（P＞0.05）,而模型组大鼠轴突髓鞘化程度随压迫时间延长而逐渐降低,在术后第8周轴突髓鞘化程度达到最低后保持在一个稳定水平。另外,模型组大鼠髓鞘化程度在术后第8、12周均显著低于假手术组（P＜0.05）。造模后第8周,通过透射电子显微镜观察到模型组大鼠的马尾神经存在明显脱髓鞘改变,而假手术组大鼠的马尾神经结构基本正常。②假手术组大鼠DRG中细胞凋亡的比例在各观察时点间无显著差异（P＞0.05）;而模型组大鼠DRG中细胞凋亡的比例呈逐渐上升趋势,术后第8周显著高于术后第4周（P＜0.05）;而术后第12周与第8周之间比较,无明显统计学差异（P＞0.05）;另外,在术后第8周和第12周模型组大鼠DRG中细胞凋亡的比例明显高于假手术组（P＜0.05）。造模后第8周,通过透射电子显微镜观察到模型组大鼠DRG神经元细胞存在明显损伤,而假手术组大鼠的DRG结构基本正常。结论:本次采用的造模方法可以在术后第8周形成行为学和病理学改变稳定的慢性LSS大鼠模型。4该模型能产生与临床患者相类似的间歇性跛行和下肢感觉功能障碍等症状,可以作为研究LSS发病机制的理想模型。同时马尾神经脱髓鞘改变和DRG神经元细胞凋亡可能是LSS的发病机制。实验三:转腰汤治疗腰椎管狭窄症的作用机制目的:以LSS模型大鼠为载体,明确转腰汤（ZYT）治疗LSS的药效作用,并进一步从马尾神经和DRG两个层面探讨该方治疗LSS的作用机制。方法:将90只SD大鼠随机分为假手术组（Sham）、模型组（Model）、转腰汤低剂量组（ZYT-L）、转腰汤中剂量组（ZYT-M）和转腰汤高剂量组（ZYT-H）,每组各15只。造模后第8周开始灌胃,转腰汤各剂量组连续灌胃8周,Sham组和Model组以等体积的蒸馏水灌胃。在开始灌胃前1天和灌胃后1周、2周、4周、8周,分别对两组大鼠进行转棒测试、电子Von Frey足底痛觉测定和足底热辐射痛阈值的测定。在灌胃8周后取大鼠马尾神经和DRG,通过LFB染色、免疫组织化学染色、TUNEL荧光检测、透射电子显微镜观察、ELISA检测、蛋白质印迹法（Western Blot,WB）检测等方法评价该方药效果及探索其作用机制。结果:（1）行为学评价:在灌胃前1天,Sham组大鼠在转棒上的行走时间、足底机械刺痛作用力和时间、足底热辐射痛阈值差异无统计学意义（P＞0.05）,模型组和ZYT各剂量组大鼠在转棒上的行走时间、足底机械刺痛作用力和时间、足底热辐射痛阈值差异无统计学意义（P＞0.05）,但模型组和ZYT各剂量组大鼠在转棒上的行走时间均短于假手术组（P＜0.05）。ZYT-H组大鼠,灌胃2、4、8周后在转棒上的行走时间、足底机械刺痛作用力和时间、足底热辐射痛阈值与Model组比较存在统计学差异（P＜0.05）。ZYT-M组大鼠,灌胃2周后在转棒上的行走时间与Model组比较存在统计学差异（P＜0.05）,灌胃4周后在转棒上的行走时间、足底机械刺痛作用力和时间与Model组比较存在统计学差异（P＜0.05）,灌胃8周后在转棒上的行走时间、足底机械刺痛作用力和时间、足底热辐射痛阈值与Model组比较存在统计学差异（P＜0.05）。ZYT-L组大鼠,灌胃4、8周后在转棒上的行走时间与Model组比较存在统计学差异（P＜0.05）,灌胃8周后足底机械刺痛作用力和时间与Model组比较存在统计学差异（P＜0.05）。（2）脑脊液ELISA检测:①Sham组大鼠脑脊液中VEGFA的表达水平均低于其余各组（P＜0.05）,ZYT各剂量组大鼠脑脊液中VEGFA的表达水平均高于Model组（P＜0.05）,ZYT-M组和ZYT-H组大鼠脑脊液中VEGFA的表达水平均高于ZYT-L组（P＜0.05）,ZYT-H组大鼠脑脊液中VEGFA的表达水平高于ZYT-M组。②Sham组大鼠脑脊液中TNF-α、IL-6的表达水平均低于其余各组（P＜0.05）,ZYT各剂量组大鼠脑脊液中TNF-α、IL-6的表达水平均低于Model组（P＜0.05）,ZYT-M组和ZYT-H组大鼠脑脊液中TNF-α、IL-6表达水平低于ZYT-L组（P＜0.05）,ZYT-H组大鼠脑脊液中TNF-α、IL-6的表达水平低于ZYT-M组（P＜0.05）。（3）马尾神经组织检测:①LFB染色:Sham组马尾神经髓鞘化程度均高于其他各组（P＜0.05）,ZYT-H组大鼠马尾神经髓鞘化程度高于Model组和ZYT-L组（P＜0.05）。②免疫组化:Model组和转腰汤各剂量组大鼠马尾神经组织中的CD34蛋白表达量均高于Sham组（P＜0.05）,ZYT各剂量组大鼠马尾神经组织中的CD34蛋白表达量均高于Model组（P＜0.05）。③WB检测:ZYT干预后各组大鼠马尾神经中p-VEGFR2、p-AKT/AKT的蛋白表达水平均高于Sham组（P＜0.05）,而且转腰汤各剂量组大鼠马尾神经中p-VEGFR2、p-AKT/AKT的蛋白表达水均高于Model组（P＜0.05）。④透射电子显微镜检测:Sham组大鼠马尾神经轴突的髓鞘结构基本正常;Model组大鼠马尾神经纤维中大量的轴突表现为髓鞘板层离散,部分髓鞘出现轴膜下水肿挤压轴索,轴浆中线粒体肿胀,且施万细胞核的核膜发生凹陷;ZYT-H组大鼠马尾神经纤维中轴突髓鞘板层离散现象较少,轴膜下未见明显水肿,轴浆中线粒体未见明显肿胀。（4）DRG组织检测:①TUNEL荧光检测:Sham组大鼠DRG组织中存在较少的凋亡细胞,而Model组大鼠DRG组织中出现大量凋亡细胞;经不同剂量ZYT干预后,ZYT-H组大鼠DRG组织细胞凋亡被显著抑制。②WB检测:转腰汤干预后,Model组大鼠DRG中p-IKK α/β和p-P65/P65的表达水平高于Sham组（P＜0.05）,而 ZYT-M 组和 ZYT-H 组大鼠马 DRG 中 p-IKK α/β 和 p-P65/P65 的表达水平均低于Sham组（P＜0.05）。转腰汤干预后,Model组大鼠DRG中BCL2/BAX的表达水平低于Sham组（P＜0.05）,而ZYT-H组大鼠马DRG中BCL2/BAX的表达水平高于 Model 组（P＜0.05）;Model 组大鼠 DRG 中 cleaved-Caspase3 的表达水平高于 Sham 组（P＜0.05）,而 ZYT-H 组大鼠马 DRG 中 cleaved-Caspase3的表达水平低于Model组（P＜0.05）。③透射电子显微镜检测:Sham组大鼠DRG中的神经细胞结构正常;而Model组大鼠DRG中的神经细胞的核内染色质凝聚,核膜凹陷,细胞质中内脂褐素增多,细胞质中大量线粒体肿胀,甚至空泡化;ZYT-H组大鼠马尾DRG中的神经细胞的细胞质中有少量脂褐素,细胞质中部分线粒体肿胀或嵴破坏。结论:ZYT可以有效改善LSS模型大鼠下肢运动和感觉功能障碍。其治疗机制可能是通过调控VEGF/VEGFR2/AKT通路促进LSS模型大鼠马尾神经血管新生改善神经供血,进而减轻或逆转压迫对马尾神经造成的继发性损害;另外通过调控NF-κ B通路抑制LSS模型大鼠DRG细胞凋亡,可能是其改善神经源性疼痛症状的主要原因。