江西稻瘟病菌致病性分化、遗传多样性与水稻抗瘟性丧失机制研究

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稻瘟病是世界水稻生产三大病害之一,由稻瘟病菌Magnaporthe oryzae(无性态:Pyricularia oryzae)引起,严重危害水稻的产量和品质,已经成为水稻高产、稳产的主要阻碍。考虑到该病害具有品种专化性以及致病分化性的特点,因此最经济、有效的防治方法就是选育抗病品种,依托品种抗性来对抗病菌侵袭与破坏。但是,大多数抗病品种在推广3~5年的时间就会因为病原菌的易变性,而普遍失去抗病性。因此,了解病菌致病性及其动态变化对于实现抗病品种选育以及品种安全布局起到重要的影响作用。为系统研究江西稻瘟病菌致病性分化、遗传结构多样性以及品种抗性情况,本研究以2006~2018年从江西不同稻区分离的1161个稻瘟病菌株为研究对象,利用7个中国鉴别寄主测定了供试菌株的生理小种类型,接种30个抗稻瘟病单基因品系测定稻瘟病菌的致病力和无毒基因型;分析了江西5个不同生态型地区稻瘟病菌群基于毒性相关基因序列的遗传多样性;通过监测江西种植面积较大的10个超级稻品种的抗性水平初步探究了品种抗性丧失机制;解析了广谱抗瘟基因Pi-zt介导的不同稻瘟病菌侵染下转录组差异。主要研究结果如下:1、江西稻瘟病菌可以分成7群49个生理小种,其中ZA、ZB、ZC群为优势种群,其中ZB13为优势小种,出现频率为18.00%,以毒性较强的强致病力菌株为主;江西稻瘟病菌在生理小种构成、优势小种、致病力年际变化方面均具有3~5年的周期性;江西历年稻瘟病菌的致病类型较为丰富且存在年度差异,菌株致病类型占各年度的总菌株数的百分比为82.79%~98.21%,优势致病型菌株占当年总菌株的百分比为3.57%~5.77%;历年稻瘟病菌的无毒基因个数为24~29个,其中Avr-Pizt、Avr-Piz5、Avr-Pik、Avr-Pik(C)在历年供试菌株中出现频率较高。2、江西5个稻瘟病菌群的189个菌株可归为108个不同的单元型,其中JXH16为优势单元型;在0.80遗传相似水平上,189个菌株可划分为21个遗传宗谱,包括1个优势宗谱,2个亚优势宗谱,12个次要宗谱,6个小宗谱,层次丰富;在群体平均水平上,病菌群体具有丰富的遗传多样性(H=0.2890,I=0.4398),且群体间差异较大;5个种群在遗传距离系数为0.02水平上可分为3个类群,但菌群遗传谱系与地理区域分布并无一定相关性。同时发现江西稻瘟病菌群体存在一定的遗传分化(HT=0.2842),群体内多样性大于群体间多样性(Hs=0.2210,Dst=0.0632),总遗传变异的77.75%存在于群体内(Gst=0.2225),群体间基因流动性较小(Nm=1.7473)。3、10个超级稻品种连续4年的稻瘟病病情指数呈上升趋势,抗性水平逐年降低。以感病品种淦鑫203和抗病品种株两优02为例,两个超级稻品种经过4年的定点栽培,分离到的稻瘟病菌优势小种菌株数逐年增加,淦鑫203上分离的菌株优势小种ZB15从2014~2017年的出现频率分别为40%、48%、62%、66%,株两优02分离菌株优势小种ZB13 4年中的出现频率分别为70%、74%、76%、82%;所测菌株的平均毒力频率也呈现逐年上升趋势,淦鑫203分离菌株连续4年的毒力频率分别为55.36%、58.69%、63.15%、65.21%,株两优02分离菌株4年中的毒力频率分别为40.25%、42.13%、42.98%、45.39%;无毒基因检测发现,分离自两个品种的稻瘟病菌无毒基因出现频率4年来均逐步下降,在与品种的抗瘟基因检测结果对比发现,株两优02不仅比淦鑫203含有更多的抗瘟基因,分离到的菌株中与抗瘟基因相对应的无毒基因数量也高于淦鑫203,并且这些无毒基因还都具有较高的出现频率。研究表明,超级稻品种抗性丧失的主要原因是品种对稻瘟病菌某一优势生理小种的定向选择,以及与致病菌中诱导品种抗瘟基因发生抗病反应的无毒基因出现频率逐年降低有关。4、选取Illumina RNA-seq测序平台来实现高通量转录组的测序处理,将得到的高质量序列(Clean reads)与其水稻参考基因组(NCBI GCA_001623365)进行比对。结果显示,有85.10%~87.49%的Clean数据比对到唯一的基因组位点。运用RPKM法得到基因表达量,在FDR≤0.001与|log2 Ratio|≥1条件下筛选得到两组具备样本间差异的表达基因。针对排列前5位的Gene Ontology(GO)进行分类可以看出,主要功能有催化活性、代谢过程、结合作用、细胞过程以及逆境响应等过程。其中,有50个差异基因能归KEGG通路,包括46个上调差异基因,4个下调差异基因。在这些通路中,包括氨基酸的生物合成、碳代谢、植物激素信号转导、RNA退化、有机酸的代谢、糖胺聚糖降解、烯类降解、类胡萝卜素生物合成等过程。研究发现,水稻品种Pi-zt抗稻瘟病的致病机理极为复杂,通过环境信息处理、新陈代谢途径以及植物激素抗病信号途径等多交叉通路实现的调节与控制,其中2个差异基因MH11g0500600(转座酶家族蛋白基因)、MH04g0435600(果胶甲基酯酶基因)与水稻抗稻瘟病密切相关。
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