论文部分内容阅读
研究背景肠易激综合征（Irritable bowel syndrome,IBS）是以腹痛或腹部不适为主要症状,同时伴有排便习惯改变和大便性状异常的一种功能性胃肠病。在IBS各亚型中,我国以腹泻型肠易激综合征（Diarrhea predominant irritable bowel syndrome,IBS-D）最多见,约占66.3-74.1%。IBS-D的病理生理机制仍不完全清楚,内脏高敏感是IBS-D重要的发病机制,约94%的IBS-D患者存在内脏高敏感,黏膜低度炎症是诱导内脏高敏感的发生主要原因之一,IBS-D的肠道黏膜炎症浸润则以肥大细胞为主。肥大细胞活化AhR-Notch1途径可能发挥了重要作用。Notch信号调节肥大细胞的分化、成熟和功能,Notch信号的增强可以导致肠黏膜肥大细胞数量增多,同时参与肥大细胞活化脱颗粒过程,增加炎症因子释放。AhR具有维持免疫细胞的稳态的重要作用,AhR的缺失可以引起肠道细胞包括肥大细胞的功能异常。近年来的研究表明,AhR可能引起Notch信号的异常,导致肠道黏膜屏障损伤和免疫激活。然而,在IBS-D结肠中AhR-Notch1 途径是否参与肥大细胞活化,目 前还不清楚。临床上IBS-D整体治疗策略旨在缓解主要症状,药物靶点单一,复发率高。中药复方具有多成分、多靶点、多途径、低经济成本等多种优势和特点,因此,探索中药有效的作用机制,对于提高IBS-D治疗效果具有十分重要的意义。肠安Ⅱ号方是治疗IBS-D肝郁脾虚证的经验方,我们的前期研究发现,肠安Ⅱ号方具有抑制肠黏膜肥大细胞活化,减少生物活性物质释放,降低肠道伤害性感觉神经元的兴奋性,从而改善内脏高敏感的作用。因此,本次研究针对IBS-D肝郁脾虚证,以AhR-Notch1途径介导的肥大细胞活化为切入点,探索IBS-D内脏高敏感的发生机制及肠安Ⅱ号方的作用机制。第一部分在体实验研究AhR-Notch1途径介导的肥大细胞活化在IBS-D大鼠内脏高敏感中的作用及肠安Ⅱ号方的干预作用研究目的1.建立IBS-D肝郁脾虚证病证结合大鼠模型,观察肠安Ⅱ号方的疗效作用;2.以AhR-Notch1途径介导肥大细胞活化为切入点,揭示肠安Ⅱ号方改善IBS-D内脏高敏感的可能机制。研究方法1.采用新生母子分离、TNBS灌肠、慢性不可预知应激刺激三因素叠加的方法建立IBS-D肝郁脾虚证病证结合大鼠模型,并从大鼠一般情况、体重、进食量、抓力、糖水偏嗜比例、血清D-木糖含量、粪便含水量、AWR评分和病理组织切片进行大鼠模型评价和肠安Ⅱ号方的疗效评价;2.观察肠安Ⅱ号方对内脏高敏感的影响:Western Blot检测PAR2、TRPV1的蛋白表达情况;3.观察肠安Ⅱ号方对肥大细胞活化的影响:免疫组化和Western Blot检测MCT的表达情况;通过甲苯胺蓝染色进行肥大细胞计数;Elisa检测各组大鼠血清 MCT、组胺、IL-4、TNF-α 含量;4.观察肠安Ⅱ号方对AhR-Notch1途径的影响:免疫组化检测AhR、Notch1分布和表达情况;Western Blot检测AhR、CYP1A1、Notch1、Hes1的蛋白表达情况;RT-PCR检测 AhRmRNA、CYP1A1 mRNA、Notch1 mRNA、Hes1 mRNA基因表达。研究结果1.模型和疗效评价结果与正常对照组比较,模型组大鼠的体重、进食量、抓力、糖水偏嗜比例均明显降低（P＜0.05）,粪便含水量、AWR评分、血清D-木糖含量均显著升高（P＜0.05）。药物干预后,与模型组比较,肠安Ⅱ号方、Kyn能够明显增加模型大鼠体重、进食量、抓力、糖水偏嗜比例（P＜0.05）,降低粪便含水量、AWR评分、血清D-木糖含量（P＜0.05）。2.内脏高敏感评估结果WB:与正常对照组比较,模型组大鼠PAR2、TRPV1蛋白表达量明显升高（P＜0.05）;与模型组相比,肠安Ⅱ号方、Kyn治疗后能够明显降低PAR2、TRPV1的蛋白表达量（P＜0.05）。3.肥大细胞活化评估结果免疫组化:MCT 阳性染色主要分布于黏膜固有层和黏膜下层。与正常对照组比较,模型组大鼠MCT的MOD值明显升高（P＜0.05）;与模型组相比,肠安Ⅱ号方、Kyn治疗后能够明显降低MCT的MOD值（P＜0.05）。WB:与正常对照组比较,模型组大鼠MCT蛋白表达量明显升高（P＜0.05）;与模型组相比,肠安Ⅱ号方、Kyn治疗后能够明显降低MCT的蛋白表达量（P＜0.05）。肥大细胞计数:与正常对照组比较,模型组大鼠结肠黏膜肥大细胞数量明显增多（P＜0.05）,肠安Ⅱ号方、Kyn治疗后肥大细胞数量明显减少（P＜0.05）。Elisa:与正常对照组比较,模型组大鼠血清MCT、组胺、IL-4、TNF-α含量明显升高（P＜0.05）,肠安Ⅱ号方、Kyn治疗后MCT、组胺、IL-4、TNF-α含量明显降低（P＜0.05）。4.AhR-Notch1途径结果免疫组化:AhR,Notch1阳性染色广泛分布于黏膜上皮全层、黏膜下层、肌层。与正常对照组比较,模型组大鼠AhR的MOD值明显降低（P＜0.05）,Notch1的MOD值明显升高（P＜0.05）;与模型组相比,肠安Ⅱ号方、Kyn治疗后能够明显升高AhR的MOD值明显降低（P＜0.05）,降低Notch1的MOD值（P＜0.05）。WB:与正常对照组比较,模型组大鼠AhR、CYP1A1蛋白表达量明显降低（P＜0.05）,Notch1、Hes1蛋白表达量明显升高（P＜0.05）;与模型组相比,肠安Ⅱ号方、Kyn治疗后能够明显升高AhR、CYP1A1蛋白表达量,降低Notch1、Hes1的蛋白表达量（P＜0.05）。RT-PCR:与正常对照组比较,模型组大鼠AhR mRNA、CYP1A1mRNA基因表达明显减少（P＜0.05）,Notch1 mRNA、Hes1 mRNA基因表达明显增加（P＜0.05）;与模型组相比,肠安Ⅱ号方、Kyn治疗后能够明显增加AhR mRNA、CYP1A1 mRNA 的基因表达（P＜0.05）,减少 Notch1 mRNA、Hes1 mRNA的基因表达（P＜0.05）。研究结论1.新生母子分离、TNBS灌肠、慢性不可预知应激刺激三因素叠加的复合造模方法能够成功建立肝郁脾虚证IBS-D内脏高敏感大鼠模型。2.肠安Ⅱ号能够有效改善IBS-D肝郁脾虚证病证结合大鼠体重、进食量减少,肠道吸收能力下降的情况,具有改善大鼠腹泻状态、降低大鼠内脏敏感性、减轻肠道低度炎症的作用。3.肠安Ⅱ号方可能通过调节AhR-Notch1途径,抑制肥大细胞活化,进而下调肠道传入神经伤害感受器PAR2、TRPV1的表达,起到改善内脏高敏感,缓解IBS-D症状的作用。第二部分体外实验研究RBL-2H3细胞活化模型的建立及基于AhR-Notch1途径研究肠安Ⅱ号方含药血清对RBL-2H3细胞活化的分子机制研究目的建立肥大细胞活化的体外模型,探讨肠安Ⅱ号方调节肥大细胞活化的分子机制和靶点。研究方法1.采用DNP-IgE致敏,DNP-HSA再激发的方法建立RBL-2H3细胞活化模型,通过评估β-Hex释放率筛选出DNP-IgE、DNP-HSA造模的最佳浓度,以及DNP-HSA激发的最佳时间;2.观察肠安Ⅱ号含药血清调节肥大细胞活化的分子机制:采用CCK8检测RBL-2H3细胞活力筛选出肠安Ⅱ号方含药血清的最佳浓度;Elisa检测各组细胞β-Hex释放率和MCT、组胺、IL-4、TNF-α含量;WB检测各组细胞p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK蛋白比值;WB检测各组细胞AhR、Notch1蛋白的表达。研究结果1.RBL-2H3细胞活化模型的建立RBL-2H3细胞β-Hex释放率随着DNP-IgE、DNP-HSA浓度的增加而增加,且都在浓度为200ng/mL时达到最高值,随后β-Hex释放率有所下降。同时RBL-2H3细胞β-Hex释放率随着DNP-HSA激发时间的增加而增加,且在1h时达到最高峰,随后β-Hex释放率出现下降。2.分子机制结果CCK8:肠安Ⅱ号方5%浓度含药血清的细胞活力高于10%、15%、20%浓度含药血清,因此选择5%浓度含药血清作用24h作为给药方案。β-Hex释放率:与正常对照组比较,模型组β-Hex释放率明显增加（P＜0.05）;与模型组比较,Kyn组、肠安Ⅱ号组β-Hex释放率明显减少（P＜0.05）;与Kyn组比较,Kyn+CH223191组β-Hex释放率增加,但差异无统计学意义（P＞0.05）;与模型+肠安Ⅱ号组比较,肠安Ⅱ号+CH223191组β-Hex释放率明显增加（P＜0.05）。Elisa:与正常对照组比较,模型组MCT、组胺、IL-4、TNF-α含量明显增加（P＜0.05）;与模型组比较,Kyn组、肠安Ⅱ号组MCT、组胺、IL-4、TNF-α含量明显减少（P＜0.05）;与Kyn组比较,Kyn+CH223191组MCT、组胺、IL-4含量明显增加（P＜0.05）,TNF-α含量有增加趋势（P＞0.05）;与肠安Ⅱ号组比较,肠安Ⅱ号+CH223191组MCT、组胺含量有增加趋势（P＞0.05）,IL-4、TNF-α含量明显增加（P＜0.05）。WB（MAPK）:与正常组比较,模型组 p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK比值明显升高,（P＜0.05）;与模型组比较,Kyn组、肠安Ⅱ号组p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK 比值明显降低（P＜0.05）;与 Kyn 组比较,Kyn+CH223191 组 p-p38/p38（P＜0.05）、p-JNK/JNK（P＞0.05）、p-ERK/ERK（P＜0.05）比值升高;与肠安Ⅱ号组比较,肠安Ⅱ号+CH223191组p-p38/p38（P＜0.05）、p-JNK/JNK（P＞0.05）、p-ERK/ERK（P＞0.05）比值升高。WB（AhR、Notch1）:与正常组比较,模型组AhR蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）,Notch1蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）;与模型组比较Kyn组、肠安Ⅱ号组AhR蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）,Notch1蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）;与Kyn组比较,Kyn+CH223191组AhR蛋白表达水平明显降低,Notch1蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）,与肠安Ⅱ号组比较,肠安Ⅱ号+CH223191组AhR蛋白表达水平明显降低,Notch1蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。研究结论1.使用终浓度 200ng/mL DNP-IgE 致敏,200ng/mL DNP-HSA 激发 1h 是 RBL-2H3细胞活化脱颗粒模型建立的最佳方法。2.肠安Ⅱ号方含药血清通过上调AhR蛋白水平、从而下调Notch1蛋白表达以及p38、ERK1/2、JNK磷酸化水平,减少生物活性物质MCT、组胺、IL-4、TNF-α释放,起到抑制RBL-2H3细胞活化的作用。