目的:乳腺癌是女性中发病率最高的恶性肿瘤,是一组具有明显异质性的肿瘤。临床上将乳腺癌分为管腔A型、管腔B型、人表皮生长因子2过表达型以及三阴型。各分型乳腺癌的基因表达谱、转移潜能、进展速度、治疗手段以及临床转归均有所不同。其中,三阴性乳腺癌缺少特效的治疗方法,肿瘤进展快,容易复发,易出现淋巴结及远隔脏器转移,并且在疾病晚期易发生化疗耐药,是预后最差的乳腺癌类型。全面了解此类型乳腺癌发生和发展的分子机制能够为寻找新的治疗靶点提供依据,有助于改善三阴性乳腺癌患者的预后。相对于其他类型乳腺癌,三阴性乳腺癌细胞上皮间质转化异常活化。上皮间质转化是指细胞从上皮细胞表型转化为间质细胞表型。形态学上表现为从圆形、多角形转变为梭形。在分子水平上,上皮间质转化的特征是上皮细胞标志物（E-cadherin、Claudin以及CK）表达的下降,以及间质细胞标志物（N-cadherin和Vimentin）的过表达。上皮间质转化能促进肿瘤细胞的干细胞化、化疗耐药、远隔脏器转移以及复发。活跃的上皮间质转化是导致三阴性乳腺癌不良预后的重要原因。随着表观遗传学的发展,转录后调控在上皮间质转化过程中的重要作用也逐步得到认视。微小RNA、长链非编码RNA以及环状RNA等类型非编码RNA广泛参与细胞的转录后调控。其中,环状RNA是一类具有环状结构的内源性非编码RNA,具有保守性、组织特异性和疾病特异性。环状RNA通常由其宿主基因的外显子和或内含子构成。因缺少Poly A尾巴结构,环状RNA比线性RNA更稳定,能够在细胞中积累足够的丰度,以其特有的机制发挥生物学功能。环状RNA能够在转录水平、转录后水平甚至翻译后水平调控肿瘤的发生和进展。越来越多的研究证明,环状RNA能调控肿瘤细胞的上皮间质转化、干细胞化以及耐药等恶性表型。在环状RNA的多种调控机制中,微小RNA海绵机制最为常见。此外,某些环状RNA被发现存在于患者的外周血中,并可作为疾病诊断和预后判断的生物标志物。本研究拟旨在寻找调控三阴性乳腺癌恶性表型的关键环状RNA分子,并探究其作用机制,为寻找新的诊断指标和治疗靶点提供科学依据。方法:第一部分:本研究首先通过GEO数据库的环状RNA芯片数据筛选出三阴性乳腺癌中高表达的环状RNA。通过q RT-PCR实验检测癌组织、癌旁组织以及乳腺癌细胞系中候选环状RNA分子的表达量。放线菌素D用于抑制细胞RNA合成,以检测circ WAC和WAC m RNA的半衰期。RNase R用于检测circ WAC对RNA酶的耐受性。琼脂糖凝胶电泳用于分离普通PCR产物。原位荧光杂交实验和核质分离PCR实验用于检测circ WAC的亚细胞定位。si RNA用于在MDA-MB-231细胞系中敲减circ WAC。过表达质粒用于在HCC1937细胞系中过表达circ WAC。CCK8实验检测细胞增殖能力,A/P双标法检测细胞凋亡率,划痕修复实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。Western blot检测上皮和间质细胞的标志蛋白来评估细胞的上皮间质转化。第二部分:首先通过生物信息学预测出可能与circ WAC结合的候选微小RNA分子以及mi R-1183的靶基因。q RT-PCR用于检测mi R-1183和SMAD2 m RNA的表达量。Western blot用于检测SMAD2蛋白以及上皮和间质细胞的标志蛋白的表达量。原位荧光杂交实验检测mi R-1183与circ WAC的亚细胞定位。双荧光素酶报告基因实验验证外源性的mi R-1183能否与circ WAC或SMAD2 m RNA的结合。RNA结合蛋白免疫沉淀实验和RNA pull down实验用于验证内源性的mi R-1183能否与circ WAC或SMAD2 m RNA结合。CCK8实验检测细胞增殖能力,A/P双标法检测细胞凋亡率,划痕修复实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。通过慢病毒转染稳定敲减circ WAC并造裸鼠皮下移植瘤模型。免疫组织化学用于检测移植瘤组织中相关蛋白的表达强度。结果:第一部分:本研究首先通过GEO数据库筛选出三阴性乳腺癌差异表达的环状RNA分子,其中上调的共82个,下调的共62个。经过验证,在前7个显著上调的环状RNA中,circ WAC的表达量明显高于癌旁组织,且在三阴性乳腺癌中的表达量高于其他类型的乳腺癌。circ WAC的高表达与淋巴结转移和脉管癌栓相关。circ WAC由其宿主基因的第4、第5、第6以及第7外显子构成。放线菌素D实验结果显示circ WAC半衰期为16小时,WAC m RNA的半衰期为仅为4个小时。琼脂糖凝胶电泳实验结果显示,circ WAC只源于转录组并且包含环状RNA特有的反向剪切点序列。此外,circ WAC能耐受RNase R的消化。以上三个实验证明circ WAC具有环状RNA分子的特性。原位荧光杂交实验与核质分离PCR实验结果显示circ WAC主要定位于细胞浆。CCK8实验结果表明敲减circ WAC后肿瘤细胞增殖率降低,过表达circ WAC后细胞增殖率增加。A/P凋亡检测结果显示敲减circ WAC后肿瘤细胞凋亡率增加,过表达circ WAC后细胞凋亡率降低。划痕修复实验表明敲减circ WAC后肿瘤细胞迁移能力减弱,过表达circ WAC后肿瘤细胞迁移能力增强。Transwell实验结果显示敲减circ WAC后肿瘤细胞侵袭能力减弱,过表达circ WAC后肿瘤细胞侵袭能力增强增。Western blot结果表明,敲减circ WAC后间质细胞标志物（N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白）表达下调,上皮细胞标志物（E-cadherin蛋白）表达上调。过表达circ WAC后上皮间质转化相关蛋白的变化趋势相反。即敲减circ WAC抑制肿瘤细胞上皮间质转化,过表达circ WAC促进肿瘤细胞上皮间质转化。以上细胞功能实验说明证明circ WAC能够促进三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及上皮间质转化,同时抑制细胞凋亡。第二部分:circ Interactome和circ Bank数据库共预测出到4个可能与circ WAC结合的微小RNA。其中,mi R-1183的表达量受circ WAC的调控最明显。mi R-1183在癌组织中低表达,并且表达量与circ WAC负相关。双荧光素酶报告基因实验结果显示,mi R-1183 mimics+circ WAC野生序列组的系统荧光强度明显下降。RNA结合蛋白免疫沉淀实验结果显示,AGO2抗体组的免疫沉淀复合物当中能检测到circ WAC与mi R-1183的表达。RNA pull down实验结果显示,包含circ WAC序列的探针能富集到mi R-1183分子。以上三项实验结果表明,circ WAC能够吸附mi R-1183。细胞功能恢复实验结果显示,同时敲减circ WAC和mi R-1183可以逆转只敲减circ WAC所导致的,包括增殖、凋亡、迁移、侵袭以及上皮间质转化在内的细胞表型改变。说明mi R-1183位于circ WAC的下游调控细胞的表型。接下来,经过生物信息学预测,SMAD2被确定为mi R-1183的靶基因。SMAD2在癌组织中高表达,其m RNA和蛋白水平的表达均受到circ WAC/mi R-1183轴的调控。双荧光素酶报告基因实验和RNA结合蛋白免疫沉淀实验结果显示,mi R-1183能够与SMAD2 m RNA的3’UTR结合。细胞功能恢复实验结果显示,在过表达circ WAC的同时敲减SMAD2,可以逆转只过表达circ WAC所导致的细胞表型的改变。证明SMAD2在circ WAC/mi R-1183轴的下游调控细胞的表型。裸鼠皮下成瘤实验的结果显示,circ WAC稳定敲减组的肿瘤体积和重量均小于对照组,Ki-67、SMAD2、N-cadherin和Vimentin的表达弱于对照组,E-cadherin的表达强于对照组。证明稳定敲减circ WAC能够在体内抑制三阴性乳腺癌细胞的生长与上皮间质转化。结论:1.circ WAC是定位于细胞浆的,在三阴性乳腺癌中显著上调的环状RNA。circ WAC高表达的病例更容易发生淋巴结转移。circ WAC能够促进三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及上皮间质转化,同时抑制细胞凋亡。2.circ WAC通过吸附mi R-1183上调SMAD2的表达,并通过mi R-1183/SMAD2轴促进肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭以及上皮间质转化,同时抑制凋亡,进而促进三阴性乳腺癌的进展。