多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme，GBM)是成人最常见的原发性恶性脑肿瘤，约占所有原发性脑肿瘤的20％。近20年来，虽然神经外科技术、放射治疗设备及化学治疗药物等方面有长足的发展，但由于GBM具有侵袭性生长及对放射治疗和常规化疗高度抵抗的特点，因此治疗效果仍不理想，仅有不到30％的GBM患者生存期超过2年。因此，在分子水平上阐明GBM发生、进展及治疗耐受的机制，探索行之有效的新型治疗手段是目前神经肿瘤研究领域的重点。　　 替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是一种新型烷化剂类化疗药物。TMZ在体内生理pH值下转化为活性产物5-(3-甲基三嗪-1-基)咪唑-4-酰胺(MTIC)，MTIC可使鸟嘌呤O6和N7位点发生烷基化修饰，造成DNA复制错配，阻断DNA复制，抑制肿瘤生长。目前，国际上治疗GBM的标准方案为手术切除后行TMZ同期放化疗，再予TMZ化疗。大规模临床研究表明，TMZ能够提高患者的两年生存率，但TMZ仅将GBM患者的中位生存期延长2个月，这表明，多数GBM对TMZ耐药。探索GBM对TMZ耐药的机制及如何逆转GBM对TMZ的耐药是当前的研究热点之一。　　 鉴于GBM对常规放疗与化疗抗拒，以及GSC在GBM发生与进展中的作用，确定GSC维持与自我更新过程中的靶分子则可能为GBM的有效治疗提供线索。信号转导与转录活化因子3(signal transduction of activators of transcription3。STAT3)是目前倍受关注的分子靶点之一。STAT3属于转录因子，在细胞内外信号的刺激下，能够被Janus激酶(Janus kinase，JAK)家族、受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTK)及Src激酶家族等激活。细胞浆中的STAT3激活后，发生二聚体化，转位进入细胞核，并与下游靶基因启动子区域上特异性位点结合，调节基因转录。STAT3的下游的基因包括Bcl-2、Bcl-XL、VEGF、c-myc及MMP等，这些基因在功能上与细胞的存活、凋亡、血管生成等重要生理过程密切相关。目前，已有包括JAK激酶抑制剂、显性负相STAT3、RNA干扰等多种途径用于抑制STAT3的活化。　　 本课题首先从手术切除的新鲜GBM标本中分离GSC，建立体外及动物模型，描述GSC在未分化及分化生长状态的特点。第二，利用MTS法检测GSC对TMZ的敏感性，并利用流式细胞法、免疫荧光标记的甲基化特异性PCR及Wester blot检测GSC中CD133阳性细胞比例、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶启动子区域甲基化状态与抑癌基因磷酸酶及张力蛋白同源基因PTEN的表达水平，并探讨以上因素与TMZ敏感性之间的关系。第三，比较正常人脑星形细胞、胶质瘤细胞系U87及GSC中活化STAT3水平。观察新型JAK2/STAT3抑制剂WP1193对GSC生长、体外自我更新、信号转导通路变化、CD133阳性细胞比例、细胞周期以及凋亡的影响。本课题拟通过以上研究，以期评价新型分子靶向治疗药物在体外对GSC的作用及探索治疗GBM的新方式。　　 第一部分、胶质瘤干细胞的分离与鉴定　　 胶质母细胞瘤(GBM)是成人常见原发性恶性脑肿瘤，预后不良。近年来，国内外实验室先后从新鲜GBM手术标本中分离出具有类似正常神经干细胞的胶质瘤干细胞(GSC)。这些细胞在体外能够自我更新及“分化”生长，在动物模型颅内形成组织学上与患者GBM相似的肿瘤。本部分研究从新鲜GBM手术标本中分离GSC，并对其进行初步鉴定。　　 目的：　　 从新鲜手术切除GBM标本中分离符合肿瘤干细胞标准的细胞群，并对其进行初步鉴定。　　 方法：　　 将手术切除的5例新鲜GBM标本制成单细胞悬液，使用含EGF及FGF但不含血清的培养基进行培养。使用神经球形成实验评价GSC的自我更新能力。使用免疫荧光技术检测未分化状态下GSC中CD133的表达及分化状态下GSC中GFAP的表达。将GSC单细胞悬液原位移植至裸鼠颅内，评价其形成肿瘤的能力以及所形成肿瘤的组织学特征。　　 结论：　　 5例GBM标本中均含有符合肿瘤于细胞标准的GSC。GSC在体外能够自我更新及“分化”生长，在动物模型形成的肿瘤，能够反映亲代肿瘤的组织病理学特征。　　 第二部分、胶质瘤干细胞对替莫唑胺敏感性的研究　　 替莫唑胺(TMZ)是目前治疗GBM的一线化疗药物。大规模临床研究表明，术后TMZ同期放化疗，再进行TMZ化疗，能够提高GBM患者的2年存活率，但仅能将患者中位存活期延长2个月，说明多数GBM对TMZ仍存在耐药。有研究表明，GSC在TMZ耐药中发挥重要作用。在本部分中，我们评价了GSC对TMZ的敏感性，并探讨可能的耐药原因。　　 目的：　　 利用MTS法检测GSC对TMZ的敏感性，同时检测GSC中CD133阳性细胞比例、MGMT启动子区域的甲基化状态及抑癌基因PTEN的表达水平，并探讨以上指标与GSC对TMZ耐药之间的关系。　　 方法：　　 MTS法检测5个GSC细胞系对TMZ的敏感性。流式细胞法检测GSC细胞系中CD133阳性细胞的比例。荧光标记的甲基化特异性PCR(F-MSP)检测GSC细胞系中MGMT启动子区域的甲基化状态。Western blot检测GSC细胞系的PTEN蛋白表达水平。　　 结论：　　 GSC对TMZ普遍耐药，与MGMT启动子区域甲基化状态及CD133刚性细胞有关，而与PTEN蛋白表达水平无明显关联。　　 第三部分、STAT3信号转导通路抑制剂诱胶质瘤干细胞导凋亡的研究　　 鉴于GBM对TMZ及常规放疗的的抗拒，以及近来研究所表明GSC在GBM治疗抗拒中的重要作用，在分子水平上更深入的了解GSC及探索能够针对GSC生存及自我更新的核心信号转导通路则显得十分必要。STAT3作为一个在干细胞维持及肿瘤发生中发挥重要作用的转录因子，是GSC生存及自我更新的潜在靶分子。本部分研究评价了GSC中活化STAT3的表达水平，以及新型STAT3信号转导通路抑制剂WP1193对GSC生物学方面的影响。　　 目的：　　 检测活化STAT3在3个GSC细胞系(T411，T402及T509)中的表达，评价新型STAT3信号转导通路抑制剂WP1193对GSC中STAT3信号转导通路上下游的影响，以及WP1193对GSC自我更新、增殖及凋亡的影响。　　 方法：　　 Western blot检测GSC中活化STAT3的表达，并与正常人脑星形细胞(normalhuman astrocyte，NHA)及胶质瘤细胞株U87进行比较。MTS法检测WP1193对GSC细胞活性的影响。神经分析法评价WP1193对GSC自我更新的影响。流式细胞法检测WP1193对T402中CD133阳性细胞的影响。Western blot检测WP1193处理后GSC中STAT3、上游JAK2及相关的PI3K及MAPK信号转导通路信号水平的变化。RT-PCR检测WP1193对STAT3下游靶基因的转录的影响。流式细胞法检测WP1193对T402细胞周期的影响，Western blot检测细胞周期调节蛋白CyclinD1及p21的变化。流式细胞Annexin V法检测WP1193在GSC中诱导凋亡的能力。Western blot检测GSC在WP1193处理后表达凋亡相关蛋白细胞色素c(cytochrome c)、caspase-3及PARP的变化。Western blot检测GSC在WP1193处理后凋亡相关蛋白Bcl-2家族成员Bcl-2、Bax、Bcl-XL及Mcl-1的表达。　　 结论：　　 STAT3在GSC中持续活化，新型STAT3信号转导通路抑制剂能够抑制STAT3的活化及下游基因的转录，从而抑制GSC的细胞活性，抑制GSC在体外自我更新的能力，下调CD133阳性细胞的比例。WP1193能够在GSC中通过下调CyclinD1及上调p21从而诱导G1期阻滞。WP1193能够在GSC中通过下调Bcl-2有效的诱导凋亡的发生。　　 论文总结：　　 本研究从5例新鲜GBM手术标本中成功分离出符合肿瘤干细胞标准的GSC。GSC在体外含EGF及FGF但不含血清的培养基中呈不贴壁的多细胞球样生长，具有自我更新能力，表达正常神经干细胞标志CD133。GSC在含血清的培养基中培养时，多数细胞呈贴壁样生长，表达胶质细胞标记物GFAP。GSC在动物模型中形成在组织病理学与患者GBM棚似的肿瘤。GSC是目前研究GBM的理想模型。我们的研究还表明，多数GSC对TMZ耐药，5个GSC细胞系中，3个细胞系对TMZ耐药，1个细胞系对TMZ中度敏感，仅有1个细胞系对TMZ敏感。GSC对TMZ的敏感性与细胞系中CD133阳性细胞比例及MGMT启动子区域甲基化状态有关。为探索有效治疗GBM的新途径，我们选择了在干细胞维持及肿瘤发生中起重要作用的STAT3。我们首次证明，GSC中高表达持续活化的STAT3。新型STAT3信号转导通路抑制剂WP1193有效抑制GSC中STAT3的活化及下游基因的转录。WP1193能够有效抑制GSC的活性及自我更新的能力。WP1193处理后能降低GSC中CD133阳性细胞的比例，通过下调Cyclin D1及上调p21诱导细胞周期抑制，并通过下调Bcl-2有效诱导凋亡的发生。总之，本研究为寻找治疗GBM的新方式提供了线索。