【研究背景】Ⅰ型电压依赖型钠通道（Nav1.1）是中枢神经系统中最重要的钠通道之一，在神经元动作电位的产生过程中发挥至关重要的作用。其功能异常所导致的离子通道病是目前为止人类最常见的通道病，已被证实与癫痫、孤独症及偏头痛等多种神经疾病相关。过去研究发现编码Nav1.1的基因SCN1A的表达受到严格的调控，具有发育依赖性和组织特异性的特点，而且在所有中枢神经系统的钠通道中，只有Nav1.1的表达量下降后缺乏被代偿机制，SCN1A基因表达水平的精确性直接影响到中枢神经系统的正常生理功能。近年来研究发现SCN1A基因存在多个启动子，分别位于不同的5′非翻译区外显子上游。这些启动子的功能差异及其对SCN1A基因时空表达的贡献还未见报道。本课题组前期研究发现SCN1A基因至少存在三个功能启动子，并且证实它们在不同细胞类型的培养细胞中存在活性差异。本研究将更加深入研究这些启动子的特征及其功能差异以及它们对SCN1A基因表达的影响。【研究目的】本研究将通过鉴定SCN1A基因最小功能启动子、核心启动子元件及5′端上游调控元件及其相应转录因子，以及比较SCN1A基因各个启动子在不同细胞系的表达差异来探索SCN1A基因在中枢神经系统中转录调控的机制，为癫痫等神经系统疾病的发病机理及诊治提供新思路。【研究方法】1.表达载体构建：通过PCR扩增，以人的SCN1A基因转录起始点5′上游4Kb片段DNA为模板，自5′端逐渐缩短及3′端延伸，扩增出不同长度片段，克隆到荧光表达载体PGL4.10中，构建重组质粒。用定点诱变分析法构建突变重组质粒。2.双荧光素酶报告基因系统检测不同长度启动子的活性，寻找到最小功能启动子及核心启动子元件。3.将鉴定出来有意义的调控元件合成用生物素标记的探针，提取NT-2细胞浆、核蛋白，进行EMSA实验在体外验证是否有蛋白与预期转录调控元件结合。4.用Biotin-Pull Down及SDS-PAGE电泳分离与预期转录调控元件相结合的NT-2细胞的核蛋白，并用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析结合蛋白的成分，并用相应的抗体进行Super-shift实验进一步验证相结合的转录因子。5.进行ChIP实验进一步体内验证特定转录因子与预期转录调控元件的结合。6.用shRNA干扰实验进一步验证转录因子的转录调控作用。【研究结果】1.在启动子活性分析中发现P1c启动子在NT-2细胞中具有很高的活性。2.鉴定出P1c启动子下游nt+53～+62是转录沉默元件。3.通过EMSA及ChIP分析发现RACK1蛋白与转录沉默元件结合发挥转录调控作用。4.通过shRNA RACK1后发现P1c的启动子活性增加及SCN1A基因转录表达增多。5.在诱导的类神经元NT-2细胞中，SCN1A基因下游的沉默元件对增加SCN1A基因的表达是必要的。并且发现在诱导的类神经元NT-2细胞中RACK1结合沉默元件的能力下降从而引起SCN1A的表达增加。【结论】本研究揭示了支架蛋白RACK1在调控SCN1A基因表达具有非常重要的作用。本实验的结果发现在未分化的NT-2细胞中，RACK1通过与SCN1A启动子下游的沉默元件结合从而负性调控SCN1A的表达；在分化的类神经元NT-2细胞中，通过RACK1介导胞核蛋白与转录沉默元件结合能力的下降而引起SCN1A表达的增加。综上本研究揭示了RACK1在神经元细胞和非神经元细胞中调控SCN1A表达的一种新的作用机制。